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推荐阅读：本文研究了啶虫脒与杀菌剂混合对蜜蜂的影响，发现其效果难以预测，需进一步研究。
### 1. 引言
学习是蜜蜂（Apis mellifera）行为的重要组成部分。蜜蜂作为中心觅食者，依靠出色的学习和记忆能力，为蜂群采集花粉、花蜜、水和蜂胶。其卓越的学习能力使其成为神经行为学的研究模型。在觅食过程中，蜜蜂会接触到多种化学物质，其中植物保护产品（PPPs）是导致传粉昆虫数量下降的主要因素之一。
PPPs 包含杀虫剂、杀菌剂和除草剂等多种类型。新烟碱类杀虫剂常被认为对有益昆虫有负面影响，其活性成分与烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）结合，可导致昆虫过度兴奋和中毒。在欧盟，部分新烟碱类杀虫剂已被禁止使用，但啶虫脒作为氰基取代的新烟碱类杀虫剂，仍被允许使用且在全球广泛应用于防治刺吸式昆虫。
目前，关于杀菌剂对蜜蜂影响的研究相对较少，而蜜蜂在野外常接触多种 PPPs 的混合物。因此，本研究旨在探究新烟碱类杀虫剂与 SBI 杀菌剂和非 SBI 杀菌剂的混合物对蜜蜂蔗糖反应性和认知能力的影响。
2. 方法
2.1 实验准备与流程
本研究进行了四个实验，测试了非 SBI 杀菌剂 Cantus? Gold（活性成分：啶酰菌胺（boscalid）200g/L、唑菌酯（dimoxystrobin）200g/L）、SBI 杀菌剂 Difcor? 250 EC（活性成分：苯醚甲环唑（difenoconazole）250g/L）与新烟碱类杀虫剂 Mospilan? SG（活性成分：啶虫脒（acetamiprid）200g/kg）组成的两种混合物在不同浓度下的效果。每个实验设置八个重复，每个重复包含四个处理组（对照组、杀虫剂组、杀菌剂组、混合物组），每组 25 只蜜蜂。实验结束后，对蜜蜂进行蔗糖反应性和学习行为测试。
2.2 PPP 处理
实验使用配制好的 PPPs，根据计算确定各物质在饲养溶液中的浓度。Cantus? Gold 浓度为 0.1mg/L 和 1mg/L，Difcor? 浓度为 0.09mg/L 和 0.9mg/L，Mospilan? 浓度为 2mg/L 和 20mg/L。通过将相应 PPPs 溶解在 30%（w/v）的糖水中制备储备溶液，再经稀释得到最终饲养溶液，每两天更换一次，储存于 6°C。对照组蜜蜂喂食纯 30% 糖水。在为期一周的处理期间，蜜蜂被置于特定条件的培养箱中，实验前分析饲养溶液对蜜蜂死亡率的影响，确保其与对照组无显著差异。
2.3 蔗糖反应性测试
在处理的第 7 天，将蜜蜂在冰上 immobilized，然后单独固定，使其头部和口器可自由活动。2 小时后，依次用不同浓度（0%、0.1%、0.3%、1%、3%、10%、30%）的糖水刺激蜜蜂触角，记录蜜蜂是否出现伸吻反应（proboscis extension response，PER），每次刺激间隔 2 分钟。最后测试蜜蜂对 50% 糖水的反应，只有对 50% 糖水有 PER 反应的蜜蜂才用于后续学习行为测试。
2.4 学习性能测试
在量化蔗糖反应性后，采用两种气味的条件反射范式测试蜜蜂的学习性能。在第一学习阶段，将壬醇（nonanol）与 50% 糖水奖励配对，丁香酚（eugenol）与苦味奎宁溶液配对。实验前先检测蜜蜂对气味的自发反应，有自发伸吻反应的蜜蜂被排除。训练时，先向蜜蜂触角施加 3 秒纯气味，接着同时施加气味和相应溶液 5 秒，若蜜蜂出现 PER，则让其饮用溶液 2 秒，同时撤回气味。两种气味和溶液各交替呈现 5 次，每次试验间隔 5 分钟。学习试验结束后进行测试试验，仅呈现气味，随后进行反转学习试验，此时丁香酚与糖水奖励配对，壬醇与奎宁溶液配对，记录蜜蜂在各阶段的反应。
2.5 统计分析
使用广义线性模型（GLM）对二进制逻辑数据进行统计分析，比较不同处理组蜜蜂的蔗糖反应曲线和学习、反转学习数据。若处理因素有显著总体效应（P < 0.05），则进行 Bonferroni 事后检验，并考虑多重比较的 α 错误。使用 GraphPad Prism? 软件绘制图表。
3. 结果
3.1 蔗糖反应性
高浓度（20mg/L）的 Mospilan? 显著降低了蜜蜂的蔗糖反应性，与对照组和杀菌剂组相比差异明显。非 SBI 杀菌剂 Cantus? Gold（1mg/L）与 Mospilan?（20mg/L）的混合物也使蜜蜂的蔗糖反应性降低。而 SBI 杀菌剂 Difcor? 与 Mospilan? 的混合物对蜜蜂蔗糖反应性无显著影响，与对照组无差异。
3.2 学习性能
所有组的蜜蜂都能学习到奖励气味。20mg/L 的 Mospilan? 显著降低了蜜蜂的学习性能，与对照组和杀菌剂组相比有显著差异。非 SBI 杀菌剂 Cantus? Gold（1mg/L）与 Mospilan?（20mg/L）的混合物同样降低了蜜蜂的学习性能。但 SBI 杀菌剂 Difcor?（0.9mg/L）与 Mospilan?（20mg/L）的混合物对蜜蜂学习性能无显著影响，与对照组蜜蜂的学习表现相似。
在反转学习阶段，所有组的蜜蜂都呈现出反转学习趋势，随着试验次数增加，对新奖励气味的反应增加。但在此阶段，未观察到处理因素对蜜蜂反应的显著影响，且 PPPs 对蜜蜂在学习和反转学习过程中对惩罚气味的反应也无影响。
4. 讨论
4.1 新烟碱类杀虫剂对非靶标生物的影响
本研究表明，高浓度（20mg/L）的啶虫脒会降低蜜蜂的蔗糖反应性和学习性能，这与之前的研究结果相符。其他新烟碱类杀虫剂如吡虫啉、噻虫啉等也有类似影响，且会影响蜜蜂的飞行活动等行为。在野生蜜蜂中，啶虫脒同样会对其生长发育、繁殖等产生负面影响。
新烟碱类杀虫剂通过与昆虫大脑中的 nAChRs 结合，干扰乙酰胆碱（ACh）的正常传递，从而影响昆虫的感官反应和学习行为。通常，昆虫体内的细胞色素 P450 单加氧酶（P450s）等酶会降解新烟碱类杀虫剂，但当杀虫剂浓度过高时，可能超出解毒机制的处理能力，导致其产生毒性作用。不同新烟碱类杀虫剂对受体的亲和力和降解能力不同，因此对传粉昆虫的毒性也有所差异。本研究结果支持了欧盟允许使用的最后一种新烟碱类杀虫剂在高浓度下会影响蜜蜂认知，可能对个体蜜蜂和整个蜂群产生长期亚致死效应的观点。
4.2 PPP 混合物对非靶标生物的影响
PPPs 混合物对昆虫的影响复杂且难以预测。杀菌剂和杀虫剂的组合可能产生协同效应，部分杀菌剂可抑制蜜蜂的主要解毒酶 P450s，干扰新烟碱类杀虫剂的正常降解，增强其毒性。但不同杀菌剂对这些酶的抑制潜力不同，即使在同一类杀菌剂中也存在较大差异，因此混合物的具体组合和浓度对最终效果至关重要。
实验中使用的配制 PPPs 可能与纯活性成分产生不同的效果，因为配制产品中除活性成分外还含有多种辅助成分，这些成分可能单独或与活性成分相互作用，对非靶标生物产生影响。例如，一些杀菌剂配方中的喷雾助剂和惰性成分会损害蜜蜂的学习性能，某些农药的辅助成分会增加熊蜂死亡率并降低其体重。
本研究中，非 SBI 杀菌剂 Cantus? Gold 与 Mospilan? 的组合在行为水平上似乎没有相互作用，而 SBI 杀菌剂 Difcor? 与 Mospilan? 的混合物却减轻了新烟碱类杀虫剂的负面影响。但这并不意味着 SBI 杀菌剂与其他新烟碱类杀虫剂或在考虑其他行为、其他传粉昆虫时不会产生危害。其他研究表明，SBI 杀菌剂与新烟碱类杀虫剂或类似作用模式的杀虫剂混合，通常会在死亡率和毒性方面表现出协同效应。本研究中 SBI 杀菌剂与新烟碱类杀虫剂混合减轻负面影响的机制尚不清楚，可能是目标生物体内的负面相互作用、耐受性诱导、激活新烟碱类杀虫剂的解毒作用等，但这些都有待进一步研究证实。此外，杀菌剂的影响具有剂量依赖性，改变 Difcor? 的浓度可能会导致混合物产生不同的效果。
4.3 杀菌剂对非靶标生物的影响
本实验显示，Cantus? Gold 和 Difcor? 单独使用时对蜜蜂的反应性和学习行为无影响，这支持了杀菌剂通常在特定条件下才对蜜蜂有害的观点。然而，也有其他研究发现杀菌剂对蜜蜂有负面影响，如啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的组合会降低蜜蜂体内 ATP 浓度、影响学习性能、缩短寿命并减小蜂群规模，部分杀菌剂还会抑制蜜蜂的成年发育。因此，需要更详细地研究不同杀菌剂对非靶标生物的影响，特别是在 PPPs 混合物中的作用。
4.4 对环境的相关性
蜜蜂通过多种途径接触 PPPs，如种子处理和喷雾处理会使 PPPs 在植物组织、花粉、花蜜等中残留。而且，实际应用中通常会使用多种 PPPs 的混合物，蜜蜂在觅食过程中也会摄取多种 PPPs，研究表明多种 PPPs 存在于蜜蜂产品中。
确定相关浓度至关重要，但野外实际残留值的测定较为困难。文献中报道的 PPPs 残留值差异很大，这使得难以估计蜜蜂在野外的实际摄入量。此外，自然降解对残留值有决定性影响，而本研究在一周的喂养期内每天更换喂养溶液，未考虑自然降解过程。实验中使用的高浓度啶虫脒（20mg/L）虽处于蜂粮检测上限，但测试高浓度 PPPs 对蜜蜂行为的影响具有重要意义，如可以评估对更敏感昆虫的潜在影响、确定亚致死效应的阈值、考虑蜜蜂同时接触多种 PPPs 的情况以及模拟野外多种应激因素共同作用的场景等。
4.5 对野生蜜蜂可能影响的比较
本研究结果不能直接应用于野生蜜蜂，但可作为评估 PPPs 毒性的指标。野生蜜蜂与蜜蜂在飞行时间、活动季节、体型大小、筑巢行为、解毒基因数量等方面存在差异，这些差异使得野生蜜蜂对 PPPs 的敏感性不同。例如，许多野生蜜蜂飞行时间与蜜蜂不同，且部分野生蜜蜂体型较小、解毒基因较少，对 PPPs 更为敏感。因此，在将蜜蜂研究结果外推至野生蜜蜂时需谨慎。
5. 结论
本研究表明，欧盟仍批准使用的新烟碱类杀虫剂啶虫脒，在浓度为 20mg/L 且经过 7 天慢性处理时，会对蜜蜂的蔗糖反应性和学习行为产生影响。PPPs 混合物对蜜蜂蔗糖反应性和学习性能的影响难以预测，非 SBI 杀菌剂与新烟碱类杀虫剂的组合未显示出明显效果，而 SBI 杀菌剂与新烟碱类杀虫剂的混合物却意外地减轻了新烟碱类杀虫剂的负面影响，这与预期的协同效应不符。
鉴于此，迫切需要进一步研究 PPPs 混合物。不同的混合物（如相同类型的杀虫剂和杀菌剂组合）可能产生不同的效果，难以得出普遍结论。未来应在不同浓度下测试 PPPs 组合，可通过荟萃分析或人工智能技术估计相互作用的性质。同时，应纳入更多对野生蜜蜂的研究，因为蜜蜂的研究结果不能直接应用于野生蜜蜂，而野生蜜蜂数量仍在持续下降。
