鼻咽癌筛查的新视角：血浆EB病毒DNA片段组学分析

本文发现血浆 EBV DNA 存在 NPC 相关片段组学特征，可增强 NPC 风险预测，为癌症筛查提供新方向。

　　

在癌症诊断领域，液体活检凭借其独特优势逐渐崭露头角，其中对循环肿瘤 DNA（ctDNA）的分析更是备受关注。鼻咽癌（NPC）作为一种与 Epstein-Barr 病毒（EBV）紧密相关的恶性肿瘤，在特定地区发病率较高。过往研究表明，血浆中的 EBV DNA 是 NPC 检测、预后评估和监测的重要肿瘤标志物。在此基础上，对血浆 EBV DNA 进行更深入的分子特征分析，有望为 NPC 的早期筛查和风险预测带来新突破。

研究背景与目的

ctDNA 分析涵盖多种分子方法，如突变、甲基化和片段组学分析等，这些方法在癌症早期检测中展现出一定潜力。然而，其在癌症筛查中的临床实际影响，如能否改善患者生存率等，仍有待进一步探究。NPC 与 EBV 的强关联性，使其成为研究 ctDNA 检测临床意义的良好模型。此前研究已证实，通过血浆 EBV DNA 的聚合酶链反应（PCR）检测进行 NPC 筛查，可提高早期 NPC 的检出率，并为患者带来生存获益。但在筛查过程中发现，部分血浆 EBV DNA 阳性者经后续检查未确诊 NPC。因此，本研究旨在深入探究血浆 EBV DNA 的分子特征差异，以提升对 NPC 风险的预测能力。

研究方法

本研究基于一个前瞻性队列展开，该队列包含 20174 名受试者，于 2013-2016 年期间招募。在两轮筛查中，均采用实时 PCR 对血浆 EBV DNA 进行检测，依据检测结果将受试者分为阴性、短暂阳性和持续阳性三组。研究聚焦于第一轮筛查中血浆 EBV DNA 短暂阳性和持续阳性的受试者，对其第一轮血液样本进行 EBV 靶向测序，分析血浆 EBV DNA 的定量、大小、末端基序和基于片段组学的甲基化分析（FRAGMA）等分子特征。

研究结果

受试者选择与特征：第二轮筛查（排除第一轮已确诊的 34 例 NPC 患者）在第一轮筛查后平均 43 个月进行，17838 名受试者参与。研究分析了 7 名第二轮确诊 NPC 患者、431 名第一轮血浆 EBV DNA 短暂阳性且第二轮未确诊 NPC 患者以及 120 名第一轮血浆 EBV DNA 持续阳性且第二轮未确诊 NPC 患者的第一轮血液样本。结果显示，这三组受试者的中位年龄无统计学差异，且分析的短暂阳性和持续阳性子集与相应总体在年龄和吸烟状态方面也无显著差异。

血浆 EBV DNA 定量分析：通过靶向测序发现，第二轮确诊 NPC 患者血浆 EBV DNA 在总靶向 DNA 片段中的比例（中位数 0.59%；四分位距 [IQR] 0.33% - 8.40%）显著高于非 NPC 的短暂阳性（中位数 0.043%；IQR 0.015% - 0.11%）和持续阳性（中位数 0.21%；IQR 0.082% - 0.49%）患者（Kruskal-Wallis 检验 p < 0.0001）。然而，通过 PCR 检测的血浆 EBV DNA 浓度在相应组间无显著差异。

血浆 EBV DNA 大小分析：研究发现，NPC 患者血浆 EBV DNA 呈现单核小体大小模式，峰值频率约为 160bp，而非 NPC 患者则无此特征。第二轮确诊 NPC 患者第一轮血液样本中的血浆 EBV DNA 具有单核小体大小模式，其 EBV DNA 大小比（定义为 80 - 110bp 短 EBV DNA 片段相对比例经相同大小范围短常染色体 DNA 片段标准化后的值）显著低于非 NPC 的短暂阳性和持续阳性患者（Kruskal-Wallis 检验 p = 0.0021）。此外，在第二轮确诊 NPC 的部分患者中，还检测到少量约 300bp 的双核小体大小范围的血浆 EBV DNA 片段，通过牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序进一步证实了 NPC 患者血浆中存在长 EBV DNA 片段。

血浆 EBV DNA 末端基序分析：通过对 NPC 患者和非 NPC 患者血浆 EBV DNA 5′末端基序的分析，发现 8 种末端基序（TT、AT、GT、TC、CT、TG、AA 和 TA）在 NPC 样本中的比例较高，被归为 “NPC 富集末端基序”；2 种末端基序（CC 和 GG）在 NPC 样本中的比例较低，被归为 “NPC 缺失末端基序”。据此提出 NPC 相关 EBV DNA 末端基序评分，第二轮确诊 NPC 患者的该评分（中位数 1.21；IQR 1.16 - 1.30）显著高于非 NPC 的短暂阳性（中位数 1.09；IQR 0.97 - 1.24）和持续阳性（中位数 1.09；IQR 1.00 - 1.14）患者（Kruskal-Wallis 检验 p = 0.041）。研究还发现，NPC 细胞中 DNASE1L3 表达下调，这可能部分解释了血浆 EBV DNA 中 CC 末端基序减少的现象。

血浆 EBV DNA 的 FRAGMA 分析：FRAGMA 技术可通过分析无细胞 DNA 的基序切割模式推断其甲基化状态。研究发现，NPC 患者血浆 EBV DNA 在高甲基化 CpG 位点的 CGN/NCG 基序比显著高于低甲基化 CpG 位点。第二轮确诊 NPC 患者血浆 EBV DNA 在 1425 个预定义 NPC 信息性 CpG 位点的调整后 CGN/NCG 基序比（中位数 0.68；IQR 0.65 - 0.69）显著高于非 NPC 的短暂阳性（中位数 0.52；IQR 0.00 - 0.72）和持续阳性（中位数 0.59；IQR 0.50 - 0.72）患者（Kruskal-Wallis 检验 p = 0.018），表明其甲基化谱与已确诊 NPC 患者相似。

综合分析与风险预测模型：综合定量、大小、末端基序和 FRAGMA 分析，设定相应截断值。结果显示，所有第二轮确诊 NPC 患者以及部分非 NPC 的短暂阳性和持续阳性患者同时跨越了所有截断值。通过建模分析，具有 NPC 相关分子特征的受试者患 NPC 的相对风险为 87.1 倍（95% 置信区间：35.2 - 215.8），相比仅通过 PCR 检测血浆 EBV DNA 水平进行风险预测，风险预测性能提升超过 10 倍。

研究讨论

本研究利用大规模前瞻性队列和存档血液样本，深入探究了 NPC 临床检测前血浆 EBV DNA 的分子特征。血浆 DNA 片段组学分析基于 DNA 非随机碎片化的原理，已开发出多种片段组学标记物用于疾病诊断。本研究进一步揭示了血浆 EBV DNA 的末端基序和 FRAGMA 特征与 NPC 的关联，且发现 NPC 患者血浆 EBV DNA 的末端基序特征与其他癌症患者血浆常染色体 DNA 相似，支持了血浆 EBV DNA 类似于 ctDNA 的观点。

在 NPC 风险预测方面，本研究证实了血浆 EBV DNA 分子分析的额外价值。尽管 NPC 组样本量相对较小，但末端基序和 FRAGMA 分析仍显示出两组间的显著差异。综合分析方法实现了协同效应，显著提升了风险预测能力。然而，目前基于下一代测序（NGS）的分析成本较高，未来需评估其在 NPC 筛查中的成本效益。同时，对于高风险受试者，探索风险降低策略，如使用抗病毒药物或 EBV 疫苗，具有重要意义。

此外，本研究结果强化了将 cfDNA 检测结果视为其他癌症风险预测指标的观点。对于 cfDNA 检测 “假阳性” 结果，应谨慎对待，因其可能暗示未来患癌风险增加。未来研究可探索多模态 cfDNA 分析，以提升其他癌症的风险预测能力。

综上所述，本研究揭示了血浆 EBV DNA 在 NPC 高风险个体中的独特分子特征，为 NPC 筛查和风险预测提供了新的策略和思路，有望推动癌症早期检测领域的发展。但仍需在独立前瞻性队列中进行验证，以进一步确认这些分析方法的性能。