抑制 TGF-β 信号通路可增强诱导多能干细胞来源的间充质干细胞成骨潜能

为解决间充质干细胞（MSCs）临床应用问题，研究人员探究 TGF-β 抑制剂对 iMSCs 分化影响，提升其成骨潜能。

　　在再生医学领域，间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）可谓是一颗璀璨的 “明星”。它就像一个神奇的 “细胞魔法师”，拥有分化成多种细胞类型的能力，还能调节免疫反应、促进组织修复，在治疗各类骨和软骨疾病、心脏病、自身免疫性疾病等方面展现出巨大的潜力。然而，这颗 “明星” 却有着一些 “烦恼”。不同组织来源和供体的 MSCs 在质量和数量上存在很大差异，就像不同产地的矿石，品质参差不齐。而且，在体外培养过程中，MSCs 容易出现衰老现象，就像人会变老一样，其功能也会随之下降。此外，异体使用时还可能面临免疫排斥问题，以及组织来源相关的伦理争议，这些问题严重限制了 MSCs 在临床上的广泛应用。

为了攻克这些难题，来自德国图宾根大学医院（University Hospital Tübingen）的研究人员踏上了探索之旅，他们将目光聚焦在诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生的间充质干细胞（iPSC-derived mesenchymal stem cells，iMSCs）上。iMSCs 有着诸多优势，它可以标准化生成，减少供体差异，还能为老年供体细胞带来 “青春活力”，并且 iPSCs 可以无限扩增，为 iMSCs 提供了几乎取之不尽的 “原料”。更为重要的是，iMSCs 可从患者自身的 iPSCs 获得，能有效降低免疫排斥风险，还避免了骨髓或脂肪组织捐赠带来的伦理问题。

研究人员在《Scientific Reports》上发表的这项研究，重点探究了选择性 TGF-β 抑制剂 SB431542（SB）对 iMSCs 分化的影响，旨在找到提升 iMSCs 质量和功能的 “密码”，为其临床应用开辟更广阔的道路。

研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，他们培养了来自三名供体的颌骨骨膜细胞（Jaw periosteal cells，JPCs）、iPSCs 和 iMSCs，并为不同细胞提供适宜的培养条件。其次是流式细胞术，通过该技术分析细胞表面标志物（如 SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-80、CD44、CD73、CD90、CD105 等）的表达情况，以此来监测细胞的分化和成熟过程。另外，还有基因表达分析技术，用于检测 iPSC 和 MSC 标记基因以及成骨标记基因的表达水平，从基因层面了解细胞的变化。

下面来看看具体的研究结果：

• iMSC 分化：研究人员对 iMSCs 的分化方案进行了优化。在诱导分化时，他们不再将 iPSCs 以单细胞悬液的形式接种，而是用细胞刮刀轻轻分离后，让其形成三维细胞聚集体。在分化的前 10 天添加 SB，结果发现细胞聚集体中心多为 iPSC 样细胞，而外层出现了纺锤形的 MSC 样细胞，且表达 CD105 的细胞在第 10 天会从边缘向外生长。之后通过控制传代时的细胞密度，利用流式细胞术分析 CD105 的表达来挑选 iMSCs。
• iMSC 表征：
  • iPSC 和 MSC 表面标志物表达：在 iMSCs 分化过程中，利用流式细胞术检测发现，iPSC 表面标志物（如 CD326、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81）的表达逐渐下降，在 P1 期基本达到稳定；MSC 表面标志物（如 CD44、CD73、CD90、CD105）则逐渐上升，大多在 P1 或 P2 期达到稳定。添加 SB 和不添加 SB 的两组细胞在这些标志物的表达上没有显著差异，但 P0 期的 iMSCs 标志物表达显示其成熟度较低。
  • iPSC 和 MSC 标记基因表达：分析 iPSC 和 MSC 标记基因表达发现，CD44 和 CD73 的表达趋势与表面标志物表达类似，在 iPSCs 中表达较低，在 JPCs 中较高，在 iMSCs 分化过程中先上升后下降。iPSC 标记基因（OCT4、NANOG、TERT）在 iPSCs 中高表达，在 JPCs 和 iMSCs 中显著下调，P0 期 iMSCs 的这些基因表达高于后期，表明其成熟过程在持续进行，且添加 SB 可能会加速成熟，但差异不具有统计学意义。
  
  
• 成骨分化：成骨分化能力是 iMSCs 应用于骨再生的关键指标。研究人员对不同代数（P2、P3、P4）的 iMSCs 进行成骨诱导，通过茜素红染色和基因表达分析来评估其成骨能力。结果发现，随着代数增加，细胞矿化程度提高，添加 SB 的 iMSCs 组矿化程度显著高于未添加组，在 P4 期差异最为明显。同时，添加 SB 组的成骨标记基因（如碱性磷酸酶 Alkaline Phosphatase，ALPL）表达也更高。
• 不同 SB 孵育方法比较：研究人员进一步探究了 SB 孵育时间和添加时间点对 iMSCs 成骨分化潜能的影响。设置了不同的处理组，结果发现，在 P0 期添加 SB 且孵育时间较长（如直到第 10 天，SB_d10）的 iMSCs，其矿化能力提升最为显著，在 P3 期矿化样本比例达到 100%，且钙磷沉淀量与 JPCs 接近；而在 P1 期添加 SB（SB_P1）的效果较差。这表明 SB 在 iMSCs 分化早期发挥着重要作用。
• 衰老标志物表达：研究人员还分析了衰老标志物（P16、P21）的表达和衰老相关 β - 半乳糖苷酶（SA-β -gal）的活性。结果显示，不添加 SB 的 iMSCs 中 P16 表达较高且无明显变化趋势，添加 SB 的 iMSCs 中 P16 表达先高后低，在 P3 期与 JPCs 相当；P21 在 iMSCs 中的表达从 P0 到 P3 逐渐下降。SA-β -gal 活性在 iMSCs 中略高于 JPCs，但两组间无显著差异。这表明 iMSCs 的成熟与对应激诱导衰老的敏感性之间存在关联。

综合上述研究结果，研究人员成功建立了一种优化的方案，能够稳定获得具有高成骨潜能的 iMSCs。通过避免 iPSCs 的分离、测量 CD105 细胞来控制细胞密度，有效减少了间充质分化过程中应激诱导的细胞衰老。在 iMSCs 分化的前 5 - 10 天添加 TGF-β 抑制剂 SB431542，显著增强了 iMSCs 的成骨潜能。而且，生成的 iMSCs 至少需要 3 代（约 25 - 30 天）才能成熟，此时其成骨潜能与原始 JPCs 相当。

这项研究成果意义重大，它为 iMSCs 的临床应用提供了更可靠的制备方法。通过优化分化方案，提升了 iMSCs 的质量和功能，有望解决目前 MSCs 临床应用面临的诸多问题，为再生医学领域带来新的希望。未来，随着研究的进一步深入，或许能看到 iMSCs 在更多疾病治疗中发挥重要作用，为患者带来更多福祉。