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研究人员为解决轮状病毒 A（RVA）重组体重组难题，用仅含 ORF 序列构建重组体，拓宽了 RVA 疫苗抗原库。
# 突破技术瓶颈：轮状病毒 A 重组体构建新策略推动疫苗研发进展
在婴幼儿的健康领域，有一种病毒堪称 “小恶魔”，它就是轮状病毒 A（Rotavirus A，RVA） 。作为引发婴幼儿严重肠胃炎并导致其住院的 “罪魁祸首”，RVA 在全球范围内肆意 “捣乱”。目前，虽然有 Rotarix 和 RotaTeq 这两种减毒 RVA 疫苗在发挥作用，在高收入国家能展现出 85 - 98% 的高效力，可到了非洲和亚洲的低收入国家，效力却大幅 “缩水” 至 50 - 64%。科学家们推测，RVA 毒株的高度变异性或许是导致疫苗效力降低的重要原因之一。
为了开发出更有效的疫苗，科研人员把目光投向了基于 RVA 毒株的新型疫苗研发。然而，研发之路困难重重，其中临床相关的人类 RVA 毒株在细胞培养中复制能力差，成为了 “拦路虎”。后来，基于质粒的反向遗传学系统的出现，让大家看到了希望，它能助力生成含人类 RVA 抗原的重组轮状病毒。但这个系统也有个 “小脾气”，它需要完整的基因组片段序列信息，尤其是难以测序的非翻译区（Untranslated Regions，UTR）序列，可目前序列数据库中大多只有开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）序列，这又给研发工作带来了新的阻碍。
在这样的背景下，德国联邦风险评估研究所（German Federal Institute for Risk Assessment）的 Roman Valusenko - Mehrkens、Reimar Johne 和 Alexander Falkenhagen 等研究人员挺身而出，决心攻克这一难题。他们开展了一项极具创新性的研究，旨在探究仅利用人类 RVA 的 ORF 核苷酸序列，能否成功构建出人类 - 猿猴重组体。研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》杂志上，为 RVA 疫苗研发领域带来了新的曙光。
研究人员开展此项研究时，用到了几个关键技术方法。首先是基于质粒的反向遗传学技术，利用该技术构建重组病毒；其次是定量 RT - PCR 和 RT - PCR 技术，用于 RNA 提取及分析，以此来确认生成病毒的身份；最后是序列比对和蛋白质结构分析技术，通过这些技术对相关序列和蛋白质结构进行深入研究。
下面来看看具体的研究结果：
- 重组体的生成：研究人员构建了多种质粒，这些质粒包含人类 RVA 的 VP7 - ORF 核苷酸序列，两侧则是猿猴 RVA 菌株 SA11 的 UTR 序列。通过基于质粒的反向遗传学系统进行实验，结果发现，在实验的多种菌株中，含有 Moz60a、Moz308、GR10924 或 Zmb5 的 VP7 - ORF 且两侧为 SA11 UTRs 的重组体能够成功生成并复制，而含有 Caf29 或 Uga8 的 VP7 - ORF 且两侧为 SA11 UTRs 的重组体则未能成功生成。这表明，原则上人类 RVAs 的 VP7 编码基因组片段的 UTR 可以被猿猴 SA11 的 UTR 替代，但重组体的生成存在一定限制。
- 点突变的影响：对未能成功生成重组体的 Uga8 和 Caf29 菌株进行深入分析，研究人员发现它们的 VP7 序列存在不寻常的氨基酸替换。通过定点突变技术，将 Uga8 中导致异常氨基酸替换的 T656C 突变进行修正后，成功生成了重组体；然而，修正 Caf29 中相应突变 C84G 后，仍未能生成重组体。这说明 Uga8 中特定的点突变是导致重组体无法生成的原因之一，而 Caf29 中导致重组体生成失败的原因更为复杂。
- 重组体的特性：对部分成功生成的重组体进行生长曲线和噬菌斑大小分析。结果显示，含有 Moz60a 的 VP7 - ORF 且两侧为 SA11 UTRs 的重组体，其复制动力学与含有原始人类 RVA UTRs 的重组体高度相似；含有 Uga8T656C的 VP7 - ORF 的重组体与 rSA11 相比，复制能力无明显差异；而含有 Zmb5 的 VP7 - ORF 的重组体复制速度明显较慢，且诱导产生的噬菌斑也明显较小。
综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。研究表明，在利用反向遗传学方法构建 VP7 编码基因组片段重组体时，完整的 UTR 序列信息并非必不可少，猿猴 RVA 的 UTR 可替代人类 RVA 的 UTR，且多数情况下能产生有活力的重组体，这成功拓宽了潜在的下一代 RVA 疫苗菌株的抗原库。不过，研究也发现，重组体的生成可能会受到潜在测序错误或内在重组限制的阻碍。未来，进一步深入探究这些限制因素，将有助于更高效地开发出新型、更有效的 RVA 疫苗，为全球婴幼儿的健康保驾护航。
