增强蜡样芽孢杆菌抗菌能力：通过优化辅酶供应的创新策略

为提升蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）0-9 抗菌活性，研究人员优化葡萄糖脱氢酶（GDH），提高其对 NAD+亲和力，增强抗菌能力。

　　在农业生产的大舞台上，病害一直是困扰作物生长的 “顽固敌人”。蜡样芽孢杆菌作为一种能在土壤和植物根际生存的有益菌，本可成为对抗病害的 “得力战将”，它能分泌抗菌肽来抑制有害微生物，保护植物健康。但现实中，它的抗菌活性却不尽如人意，这就像一位怀揣绝技却发挥不出实力的武林高手，严重限制了其在生物防治领域的应用。

与此同时，辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其还原形式在微生物的生命活动中扮演着极为重要的角色，不仅参与众多氧化还原反应，还在信号传导、蛋白质修饰等过程中发挥关键作用。研究发现，NAD⁺代谢与微生物的生物防治能力存在着千丝万缕的联系。这就如同在黑暗中点亮了一盏明灯，让科研人员看到了提升蜡样芽孢杆菌抗菌能力的新方向。

为了挖掘蜡样芽孢杆菌的潜力，让它在生物防治中发挥更大作用，河南大学、北京师范大学珠海分校等多所院校的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为解决农业病害问题带来了新的希望。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。通过转录组分析探究基因转录水平变化，筛选出与抗菌活性相关的基因；借助饱和诱变技术对葡萄糖脱氢酶（GDH）关键位点进行改造；利用分子对接和分子动力学模拟从分子层面揭示突变对酶活性的影响机制；采用牛津杯法测定菌株的抗菌活性。

研究结果如下：

• 抗菌活性分析：从健康小麦根部分离出的蜡样芽孢杆菌 0-9，对多种病原菌具有抑制作用，其抗菌成分是一种肽类化合物。转录组分析显示，GDH 基因转录水平与抗菌活性呈正相关。过表达 GDH 基因后，重组菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性从 6.98 U/mL 提升至 11.59 U/mL，抑菌圈直径也有所增加12。
• 关键残基选择：研究人员通过保守性分析和分子对接，筛选出 11 个 GDH 蛋白中低保守性残基作为潜在突变位点。这些位点可能对酶与底物 NAD⁺的结合及催化效率有重要影响34。
• 构建与纯化：设计简并引物，经高通量定向进化系统筛选出 8 个阳性突变体，对其进行纯化和活性测定。发现 N97F、N192L、E198C 等突变体的催化效率显著提高，以 N97F 为模板进行组合突变，获得了 N97F/N192S/E198G 突变体，其比酶活达到 289.74 U/mg，是野生型的 5.66 倍56。
• 动力学参数测定：测定野生型和突变体的动力学参数，发现突变体的最适温度和 pH 发生变化，且底物亲和力增强。N97F/N192S/E198G 突变体的 K_cat/K_m值为 4.95 μM^-1·min^-1 ，是野生型的 11.38 倍78。
• 分子对接与动力学：分子对接表明，GLY94、GLY14 和 ILE191 形成的三角形区域影响底物亲和力和酶活性。分子动力学模拟显示，突变体活性口袋周围 5 个区域的柔性增加，促进了 NAD⁺与活性位点的结合910。
• 突变体对蜡样芽孢杆菌抗菌活性的影响：表达 N97F/N192S/E198G 突变体的蜡样芽孢杆菌 0-9，细胞内 NADH 水平显著升高，NADH/NAD⁺比值达到 1.56，抗菌活性提升至 22.79 U/mL，比表达野生型 GDH 的菌株高 96.64%1112。

研究结论表明，研究人员成功构建了具有更高 NAD⁺亲和力和催化活性的 N97F/N192S/E198G 突变体。该突变体提升了蜡样芽孢杆菌 0-9 的抗菌活性，使其达到初始菌株的 3.26 倍。分子对接和动力学分析揭示了突变体活性增强的机制，为促进细胞内 NAD (P)⁺代谢循环和提高抗菌肽合成提供了新的思路和方法。这一研究成果在生物防治和工业生产领域具有广阔的应用前景，有望为农业生产带来更绿色、高效的病害防治策略，推动相关产业的发展。