编辑推荐：
研究人员为监测鼠类和鼩鼱携带的微小核糖核酸病毒（Picornaviruses），开发了多重 TaqMan 探针实时定量 PCR（qPCR）检测方法，该方法灵敏度高、特异性强，有助于防控相关人畜共患病。
在神秘的微生物世界里，微小核糖核酸病毒（Picornaviruses）一直是人类和动物健康的潜在威胁。这类病毒家族庞大，截至 2024 年 3 月，家族内已有 159 个成员，分属于 68 个属 ，很多都具备跨物种传播的能力，能在人类和各种动物之间肆意传播，严重影响健康。
鼠类和鼩鼱看似毫不起眼，实则是超过 60 种人类传染病的 “帮凶”。它们悄无声息地携带病原体，通过尿液、粪便，或是借助节肢动物寄生虫传播疾病。近年来，越来越多的微小核糖核酸病毒在这些小动物身上被发现。像柯布病毒（Kobuvirus），最初在肠胃炎患者粪便中现身，之后在不同哺乳动物里都有踪迹，美国和匈牙利的鼠类粪便样本中，它的检出率分别高达 50% 和 55.5% 。帕里病毒 B（Parechovirus B ），从田鼠身上分离出来，与心肌炎、胰岛素依赖型糖尿病、格林 - 巴利综合征等疾病有关。还有玫瑰病毒 B（Rosavirus B）和亨尼病毒（Hunnivirus），是近十年新发现的病毒，虽然目前还没有人类感染的报道，但鉴于病毒跨物种传播的 “前科”，其感染人类的可能性不容小觑。
然而，目前对于这些鼠类和鼩鼱携带的微小核糖核酸病毒，我们了解得还远远不够。现有的检测方法，比如传统的单重 PCR，一次只能检测一种病毒，既耗时又费力，在面对多种病毒同时感染的情况时，更是力不从心。因此，开发一种快速、高效的检测方法迫在眉睫。
为了解决这些问题，南方医科大学公共卫生学院流行病学系的研究人员 Shunchang Fan、Minyi Zhang 等人开展了相关研究。他们成功开发出一种基于 TaqMan 探针的多重实时定量 PCR（qPCR）检测方法，能够在同一反应管内快速、同时检测出柯布病毒、帕里病毒 B、玫瑰病毒 B 和亨尼病毒。这一成果发表在《Virology Journal》上，为防控相关人畜共患病带来了新的希望。
研究人员开展这项研究，主要用到了以下几个关键技术方法：首先是引物和探针设计，针对不同病毒的保守区域设计引物和探针，并选用不同荧光染料标记以便区分。其次是构建质粒标准品，通过提取病毒 RNA、反转录、克隆等步骤获得。最后是优化反应体系，对引物和探针浓度进行调整，确定最佳反应条件，同时对临床样本进行检测验证。研究中使用的 149 份鼠类和鼩鼱粪便样本，均采集自中国南方四个地区。
研究结果如下：
- 单病毒单重实时定量 PCR 检测：为构建多重 qPCR 检测方法打基础，研究人员先为每种目标病毒建立单重 qPCR 检测方法。结果显示，设计的引物和探针效果良好，标准曲线的相关系数和扩增效率都很出色，这表明它们适合用于后续的多重 qPCR 检测。
- 多重实时定量 PCR 反应体系优化：经过对不同浓度的引物和探针进行测试，对比荧光强度和 Cq 值，确定了最佳工作浓度。引物的最佳浓度为 0.2μM，探针为 0.1μM，在此条件下，反应体系能达到最佳检测效果。
- 多重实时定量 PCR 的标准曲线和灵敏度：基于质粒标准品的稀释构建标准曲线，结果表明该方法能有效扩增目标病毒基因组序列，在 1×102 - 1×10? copies/μL 范围内呈现良好的线性关系。进一步检测发现，该方法对柯布病毒、帕里病毒 B 和玫瑰病毒 B 的检测限为 100 copies/μL，对亨尼病毒的检测限为 50 copies/μL ，比传统单重 RT - PCR 灵敏度更高。
- 多重实时定量 PCR 的特异性和重复性：实验证明，该检测方法特异性很强，引物和探针只会扩增对应的目标病毒基因组，不会出现交叉反应或非特异性扩增。同时，重复性也很好，组内和组间实验的变异系数（CV）都很低，说明检测结果稳定可靠。
- 临床样本检测：用建立好的多重 qPCR 方法检测 149 份临床样本，发现柯布病毒、玫瑰病毒 B 和亨尼病毒的检出率分别为 20.1%、33.6% 和 12.1%，帕里病毒 B 未检出。样本中病毒共感染率为 14.1%，且该方法检测结果与传统单重 PCR 和测序结果完全一致。
研究结论和讨论部分指出，这项研究成功开发的 TaqMan 探针多重 qPCR 检测方法，灵敏度高、重复性好，能同时检测鼠类和鼩鼱携带的多种微小核糖核酸病毒。这一方法不仅能高效检测病毒共感染情况，还降低了人力和物力成本。不过，更高的灵敏度也可能带来假阳性风险，所以严格遵守实验室操作规范至关重要。此外，病毒共感染可能引发基因重组，产生更具危害性的病毒株，因此加强对这些小动物的病毒监测刻不容缓。总的来说，该研究成果为监测和预防相关人畜共患病提供了重要的技术支持，对保障人类和动物健康意义重大。
