昼夜节律调控肌肉再生新机制：NAD+、中性粒细胞与肌肉干细胞的交互作用

为探究肌肉再生机制，研究人员研究肌肉干细胞生物钟与免疫微环境关系，发现 NAD+等关键因素影响再生。

　　在生命的奇妙旅程中，人体就像一个精密运转的时钟，各个生理过程都有着自己的节奏。其中，昼夜节律就如同这个时钟的核心齿轮，它调控着新陈代谢、免疫功能以及组织再生等重要生理活动，确保它们在一天中最合适的时间（TOD）进行。在肌肉再生这个复杂的过程里，肌肉干细胞（SCs，又称卫星细胞）和免疫系统相互协作，共同修复受损的肌肉组织。然而，尽管之前的研究表明肌肉修复效率会随昼夜变化，且 SCs 的生物钟对肌肉再生有影响，但 SCs 的昼夜节律时钟究竟如何调控肌肉修复，背后的机制却一直是个未解之谜。同时，中性粒细胞与 SCs 之间的相互作用，尤其是在肌肉损伤引发的代谢变化背景下，也有待深入探索。

为了揭开这些谜团，来自美国的研究人员开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为我们理解肌肉再生的机制带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法。在动物实验方面，使用了多种基因工程小鼠模型，如 CytoLbNOX^LSL/LSL小鼠、B6.Cg-Pax7^{tm1(cre/ERT2)Gaka}/J 小鼠和 Pax7-zsGreen 小鼠等，通过特定的杂交和处理，实现对特定基因的调控和细胞的标记。在细胞和分子生物学实验技术上，运用 RNA 测序（包括 bulk RNA 测序和单细胞 RNA 测序），分析不同状态下细胞的基因表达谱；利用免疫组化、免疫荧光等技术检测蛋白质表达和细胞间相互作用；通过 Western blotting 测定蛋白表达水平；借助 ELISA 测定细胞因子浓度。此外，还进行了肌肉损伤模型构建、肌肉细胞分离培养、细胞移植等实验操作。

研究结果如下：

1. ASCs 表达调节无氧糖酵解和中性粒细胞功能的基因：肌肉受伤后会形成急性缺氧环境，SCs 也会受到这种缺氧应激的影响。研究发现，在受伤后的早期，SCs 会通过丙酮酸发酵生成 NAD⁺。对静止 SCs（QSCs）和激活 SCs（ASCs）进行 RNA 测序分析，结果显示，与 QSCs 相比，受伤后 1 天的 ASCs 中，与缺氧和糖酵解信号通路相关的基因显著上调，同时与炎症反应，特别是中性粒细胞趋化和迁移相关的基因也高度表达。这表明 ASCs 可能在肌肉再生的早期阶段调节中性粒细胞的活性。
2. SCs 表达与中性粒细胞附着、黏附和趋化吸引相关的基因：通过对受伤后不同时间点的肌肉单核细胞进行单细胞 RNA 测序，研究人员构建了包含多种细胞类型的转录组图谱。在这个图谱中，鉴定出两种不同的中性粒细胞亚群 Neutrophils_1 和 Neutrophils_2，且发现 ASCs 可能参与调节中性粒细胞的活性，特别是对 Neutrophils_1 的影响。进一步分析发现，MuSCs 与中性粒细胞之间的通信在受伤后 1 天最为显著，且不同时间点的相互作用涉及不同的信号通路，如层粘连蛋白和胶原蛋白信号通路，以及 α 和 β 趋化因子相关的信号通路。
3. NAD⁺促进趋化因子基因表达和再生过程中的中性粒细胞募集：研究表明，缺氧会使野生型成肌细胞中的总 NAD⁺水平增加。通过在成肌细胞中表达胞质 NADH 氧化酶（LbNOX），发现可以提高细胞内 NAD⁺/NADH 比值，且^Ccl2基因的表达不仅能被缺氧诱导，还能被cytoLbNOX诱导。体内实验也证实，cytoLbNOX驱动的 NAD⁺增加可以增强再生肌肉中的中性粒细胞募集。机制研究发现，NAD⁺可能通过 PARP1 介导的多聚 ADP 核糖基化（PARylation）和 NF-κB 激活来调节Ccl2的表达。
4. 缺氧对免疫调节基因表达的调控受昼夜节律控制：研究人员发现，Bmal1 基因敲除的原代成肌细胞在急性缺氧后，趋化因子信号通路相关基因显著下调。对野生型小鼠在不同时间点（ZT4 和 ZT16）进行心脏毒素诱导的肌肉损伤实验，结果显示，受伤后 1 天，ZT16 时间点的 ASCs 中与缺氧反应和炎症反应相关的基因上调更为明显，且Ccl2基因在 ZT16 时的表达显著高于 ZT4。体外同步化实验也表明，Ccl2的表达具有昼夜节律性，且 PARP1 介导的机制参与了这种昼夜节律性变化。
5. Ccl2表达与 TOD 依赖的 SC 增殖差异相关：分析 MuSC 群体的单细胞转录组图谱，发现不同的 MuSC 亚群具有不同的基因表达特征和分化轨迹。对不同时间点（ZT4 和 ZT16）的 MuSC 亚群进行分析，发现与细胞周期相关的基因在 ZT4 和 ZT16 存在差异表达，且 ZT16 时的 SC 增殖更为活跃。体内实验也证实，过表达Ccl2的 SC 移植后，受体小鼠肌肉中的 SC 增殖明显增加。
6. 中性粒细胞耗竭减弱 TOD 对 SC 和肌肉再生的影响：对小鼠进行重复的肌肉损伤实验，发现受伤时间（ZT4 或 ZT16）会对肌肉再生产生长期影响，ZT4 受伤的小鼠肌肉再生效果较差。通过使用 Ly6G 抗体耗尽中性粒细胞后发现，中性粒细胞的缺失会减少 SC 的增殖，且减弱 TOD 对肌肉再生的影响，表明中性粒细胞是肌肉修复过程中 TOD 效应的关键调节因子。

综合上述研究，研究人员揭示了肌肉损伤后，缺氧的胞质 NAD⁺再生通过激活 PARP1 和 NF-κB 通路，促进细胞增殖并调节促炎信号，吸引中性粒细胞并促进其与 MuSCs 的相互作用，进而影响肌肉干细胞的激活和增殖，最终影响肌肉再生的效果。同时，昼夜节律通过调节缺氧诱导的无氧 NAD⁺再生，使肌肉修复效果呈现出 TOD 依赖的差异。这一研究成果不仅为我们理解肌肉再生的机制提供了新的视角，也为治疗肌肉损伤相关疾病以及改善肌肉功能提供了潜在的新靶点和治疗策略。然而，研究也存在一定的局限性，如无法完全排除昼夜节律对 1 天损伤后 ASCs 基因表达的潜在影响，以及缺氧和昼夜节律对游离胞核 NAD⁺池的影响尚不清楚等。未来，还需要进一步深入研究，以更好地理解时钟调节的 NAD⁺代谢在免疫调节中的作用，特别是在急性和慢性疾病状态下的机制，为生命科学和健康医学领域的发展提供更多的理论支持和实践指导。