RPL19-TRAPKI-seq 新方法：解锁天然产物药物机制的 “金钥匙”

为探究天然产物作用机制，研究人员开发 RPL19-TRAPKI-seq 方法，揭示 SBF-1 作用机制，助力药物研发。

　　在药物研发的 “神秘森林” 中，天然产物一直是备受瞩目的 “宝藏”。过去几十年间，许多药物和新化学实体都源自天然产物及其衍生物，它们在对抗癌症、艾滋病、阿尔茨海默病等多种疾病方面展现出巨大潜力。然而，天然产物的复杂分子结构却像是一把 “双刃剑”，一方面赋予它们独特的生物活性，另一方面却也导致其成药性不佳。因为在细胞内，它们容易与生物分子发生非特异性相互作用，而且其分子靶点往往不明确，作用机制也研究不足，这就如同在黑暗中摸索，严重阻碍了天然产物在药物研发领域的进一步发展。

为了攻克这些难题，来自复旦大学上海医学院、重庆医科大学等多家机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Natural Products and Bioprospecting》杂志上，为解开天然产物的神秘面纱带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先是翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification，TRAP）技术，该技术可以从组织或细胞裂解物中分离和富集核糖体，并捕获正在翻译的 mRNA。研究人员对其进行优化，筛选出了更具优势的核糖体蛋白 RPL19。同时，结合 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建了稳定表达 EGFP-RPL19 的细胞系。最后，将优化后的 TRAP 方法与 RNA 测序（RNA-seq）相结合，建立了 RPL19-TRAPKI-seq 系统。

研究结果

1. 优化 TRAP 方法提高核糖体纯化效率
   研究人员利用 PyMOL 软件分析人类 80S 核糖体的晶体结构，预测出 8 种符合条件的核糖体大亚基蛋白。通过克隆、转染、免疫沉淀等实验，比较它们的表达和富集效率，发现 RPL19 的富集效率最为显著，优于传统使用的 RPL10A。用毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理细胞的实验进一步验证，优化后的 TRAP 方法在检测化合物诱导的 RNA 变化方面比总 RNA 检测更灵敏、更快速。
2. 成功构建 EGFP-RPL19 敲入细胞系
   运用 CRISPR 技术，研究人员将增强绿色荧光蛋白（EGFP）插入到 RPL19 基因的第二个外显子 N 端，成功构建了 EGFP-RPL19 敲入细胞系。实验表明，该细胞系能可靠且选择性地富集核糖体和 mRNA，插入 EGFP 基因不影响细胞整体翻译水平，且具有特异性富集核糖体蛋白的能力。
3. RPL19-TRAPKI-Seq 在药物机制研究中的可行性
   以雷帕霉素（rapamycin）为研究对象，它是一种已知的 mTOR 抑制剂。用雷帕霉素处理 EGFP-RPL19 敲入细胞，对总 mRNA 和 TRAP mRNA 进行 RNA-Seq 分析。KEGG 富集分析显示，雷帕霉素影响多个途径，证实了 mTOR 是雷帕霉素的内源性靶点，这表明 RPL19-TRAPKI-Seq 系统在小分子药物机制研究中可行且有效，能减少背景干扰。
4. RPL19-TRAPKI-Seq 揭示抗肿瘤化合物 SBF-1 干扰氧化磷酸化
   OSW-1 是一种具有强大细胞毒性的甾体皂苷，其类似物 SBF-1 抗肿瘤活性相似且更易合成，但作用机制不明。研究人员用 RPL19-TRAPKI-Seq 研究 SBF-1，发现它会影响氧化磷酸化途径中的蛋白质复合物 I/III，导致线粒体相关基因下调。进一步实验表明，SBF-1 通过破坏氧化磷酸化和抑制线粒体呼吸来诱导细胞死亡。

研究结论与讨论

该研究成功优化并应用了 RPL19-TRAPKI-Seq 系统，用于化合物机制研究，尤其是抗肿瘤化合物 SBF-1。与传统转录组 RNA 测序相比，TRAP RNA 测序在确定雷帕霉素作用机制时特异性更强，准确显示了其对翻译和能量代谢途径的抑制作用，验证了优化系统在识别药物靶点和阐明作用机制方面的可行性和特异性。同时，该研究将 SBF-1 的作用机制锁定为影响细胞内线粒体氧化磷酸化。

不过，RPL19-TRAPKI-Seq 系统也存在一些局限性。它对核糖体结合的 mRNA 存在偏好，可能会遗漏一些非核糖体相关转录本；无法直接识别药物靶点；且以 mRNA 水平代替蛋白质活性并不总是准确的。未来可将 TRAP 技术与其他互补的靶点识别技术相结合，以更好地研究活性小分子的作用机制，推动药物研发。

总的来说，这项研究意义重大，RPL19-TRAPKI-Seq 系统为化合物机制研究提供了一种新的、高效且经济的方法，为未来研究小分子如 SBF-1 等的作用机制奠定了基础，有望推动药理学和治疗学领域的发展。