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为解决 RNA 检测难题，研究人员优化 SCas12a 系统，实现对高度结构化 RNA 的精确检测，推动分子诊断发展。
在生命科学的微观世界里，RNA（核糖核酸）检测是探索生命奥秘、诊断疾病的重要手段。然而，传统的 RNA 检测方法就像拿着一把钝刀去完成精细的雕刻，面对具有复杂结构的 RNA 时，总是力不从心。比如，一些长链 RNA 拥有复杂的二级结构，就像缠绕在一起的乱麻，现有的基于 CRISPR（规律成簇间隔短回文重复序列）/Cas12a 系统的检测方法，在检测这些 RNA 时，要么无法准确识别，要么检测灵敏度不够，难以满足科研和临床诊断的需求。因此，开发一种更高效、精准的 RNA 检测方法迫在眉睫。
湖北大学、武汉轻工大学等研究机构的研究人员勇敢地迎接了这一挑战，他们开展了关于优化 CRISPR/Cas12a 系统用于 RNA 检测的研究。最终，他们成功开发出一种名为 SCas12aV2 的检测技术，这一成果发表在《Communications Biology》上，为 RNA 检测领域带来了新的曙光。
研究人员在开展此项研究时，用到了多种关键技术方法。首先是对 Cas12a 蛋白的改造技术，通过调整支架 RNA（scaffold RNA）的长度、靶向不对称 RNA 结构等方式优化系统；其次是体外转录切割荧光检测技术，用于评估不同条件下 Cas12a 对 RNA 的检测能力；此外，还利用了预测结构建模技术分析检测过程中的结构变化，以及临床样本检测技术验证该方法在实际中的应用效果。
下面来看具体的研究结果：
- Cas12a 对不同长度支架 RNA 的耐受性：研究人员以 AsCas12a（一种源自酸胺球菌属的 Cas12a 同源物）为研究对象，利用不同长度的支架 RNA（S3 - S12）和单链 DNA（ssDNA）激活剂进行实验。结果发现，Cas12a 能够容忍不同长度的分裂支架 RNA，其中 26 个核苷酸的 S6 支架 RNA 在检测 RNA 时表现最佳，其体外转录切割荧光实验数据表明，S6 支架 RNA 能有效恢复野生型 Cas12a 核糖核蛋白（RNP）的全部反式切割能力12。
- 识别不对称结构增强 RNA 检测灵敏度：以往的检测方法在识别具有复杂二级结构的 RNA 时存在局限性，如难以检测 HCV（丙型肝炎病毒）片段中含茎结构的区域。研究人员假设 SCas12aV2 系统可改善这一情况，通过实验发现，靶向对称茎结构时检测效率较低，而设计针对不对称结构的 S6 ssDNA 激活剂后，荧光强度显著增强，证明该系统能实现对长 RNA 分子中复杂二级结构的高灵敏度检测。同时，利用 AlphaFold Server 进行预测结构建模分析，揭示了 SCas12aV2 检测灵敏度提高的结构基础34。
- 利用 dsDNA - ssDNA 杂交激活剂增强检测能力：研究人员尝试使用 dsDNA - ssDNA 杂交激活剂（S6.1），通过体外切割实验发现，与传统的 dsDNA 或 ssDNA 激活剂相比，S6.1 激活剂在检测长链且结构复杂的 RNA（如人类 TP53 基因的 RNA 片段）时，荧光强度更高，能检测到之前难以检测的区域，并且检测速度更快。这表明杂交激活剂可显著增强荧光检测的性能，其作用机制与促进 RNA 底物和 Cas12a 活性位点之间更强、更稳定的相互作用有关56。
- SCas12aV2 检测技术在不同 Cas12a 同源物中的应用：研究人员对 LbCas12a 和 CtCas12a 等不同 Cas12a 同源物在 SCas12aV2 检测技术中的性能进行评估。结果显示，dsDNA - ssDNA 杂交激活剂适用于所有测试的 Cas12a 同源物，但不同同源物的检测效率有所差异。其中，LbCas12a 检测效率较低，而 CtCas12a 在检测复杂结构和高 GC 含量的 RNA 时表现出更高的灵敏度，尤其在 55°C 时活性增强78。
- SCas12aV2 检测技术的检测限和突变检测特异性：研究人员利用荧光检测和侧向流动检测（LFA）评估 SCas12aV2 检测技术的检测限（LoD）。结果表明，该技术在检测不同 RNA 时，检测限低至 10 pM，使用混合激活剂时可低至 246 aM，并且能通过侧向流动检测实现低至 1 pM 的检测限。在突变检测特异性方面，以 HIV（人类免疫缺陷病毒）片段为研究对象，发现该技术对单核苷酸多态性（SNP）的检测灵敏度具有位置依赖性，且能识别 PAM（原间隔序列邻近基序）远端区域的点突变，拓宽了系统的应用范围910。
- SCas12aV2 检测技术的实际应用：研究人员在实际研究中验证了 SCas12aV2 检测技术的有效性。在检测活细菌数量时，通过调整大肠杆菌（E. coli）悬液中活细菌与死细菌的比例，发现该技术检测的荧光强度与活细菌比例呈正相关，能够定量活细菌数量。在检测 SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型）感染的临床样本时，研究人员从确诊患者的鼻拭子样本中成功提取 RNA，利用该技术准确识别出所有阳性样本，且检测结果具有定量能力1112。
研究结论和讨论部分指出，SCas12aV2 检测技术具有诸多优势。它无需扩增即可直接检测高度结构化的 RNA 分子，简化了检测过程，降低了污染和假阳性的风险；通过基于结构的设计减少了空间位阻，提高了检测的灵敏度和动力学；适用于多种 Cas12a 同源物，展现出良好的通用性；检测灵敏度高，对 SNP 的特异性强，在实际应用中能准确检测活细菌数量和临床样本中的 RNA。然而，该技术也存在一些挑战，如需要为每个目标 RNA 定制激活剂，且可能难以区分密切相关的序列。未来可通过整合机器学习技术优化激活剂设计，以解决这些问题。总的来说，SCas12aV2 检测技术是分子诊断领域的一项重大进展，为科研、临床诊断和传染病监测提供了有力的工具，具有广阔的应用前景。
