CeDaD 检测法：同时追踪细胞生死的创新工具

研究人员开发 CeDaD 检测法，同时量化细胞分裂和死亡，为细胞生物学研究提供新工具。

　　在细胞的微观世界里，细胞的分裂与死亡就像一场永不停歇的 “拔河比赛”，二者的平衡对细胞群体的发展至关重要。细胞分裂（cell division）是细胞周期（cell cycle）的最终结果，一个细胞一分为二，是细胞群体扩张的主要动力；而细胞死亡（cell death）则会让细胞群体规模缩小，其中凋亡（apoptosis）是生理性细胞死亡的主要方式。这两个过程紧密相连，比如肿瘤抑制蛋白 p53，它既能诱导细胞凋亡，又在细胞周期停滞中发挥重要作用。

在细胞生物学研究里，评估细胞群体的生长情况非常关键。以往，研究人员为了了解细胞群体的生长速率，开发了很多检测系统。简单直接的细胞计数法，操作起来费时费力；一些化学高通量检测，像 ATP 检测、基于四氮唑盐的 MTT 和 WST 检测，虽然操作简便，但这些方法通过代谢标记间接推断细胞群体生长，容易受到干扰产生误差。在研究细胞周期活性时，常用的溴脱氧尿苷（BrdU）和乙炔基脱氧尿苷（EdU）染色法，容易出现诸如细胞未完成完整细胞周期就进行内复制的假象。而检测细胞死亡的方法，如 TUNEL 检测、半胱天冬酶（caspase）检测等，也都各有局限。并且，目前能同时定量分析细胞分裂和死亡的方法少之又少。

为了攻克这些难题，德国莱比锡大学医学院（Faculty of Medicine, University of Leipzig）的 Lukas N?ltner、Kurt Engeland 和 Robin Kohler 等研究人员开展了相关研究，他们的研究成果发表在《Cell Death Discovery》上。

研究人员开发了一种名为 CeDaD 检测法（Cell Death and Division assay，即细胞死亡和分裂检测法）的新型检测方法。该方法主要用到了流式细胞术（flow cytometry） ，结合基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的 CellTrace Violet 检测来监测细胞分裂，以及基于膜联蛋白 V（annexin V）的 Apotracker Green 染色和碘化丙啶（PI）染色来评估细胞死亡程度。

下面来看看具体的研究结果：

• 传统检测方法的局限性：研究人员用 MDM2 抑制剂 AMG 232、CDK7 抑制剂 YKL-5-124 和 PLK1 抑制剂 volasertib 这三种化合物处理 HCT116 细胞（一种人结肠癌细胞系），通过细胞计数和 WST 检测评估细胞群体生长情况。结果发现，这两种方法都能显示出三种化合物对细胞生长有抑制作用，但细胞计数和 WST 检测在评估 AMG 232 和 volasertib 的效果大小时存在显著差异。这表明像 WST 检测这样的代谢检测方法存在局限性，凸显了细胞计数在与 CeDaD 检测法对比时的重要性。
• CeDaD 检测法可分析细胞分裂和死亡速率：CeDaD 检测法能在一个细胞样本中同时分析细胞分裂和死亡速率。以 HCT116 细胞为例，经过 48 小时孵育后，根据 CellTrace Violet 染色强度对细胞进行分类，判断细胞的分裂次数，进而计算出细胞分裂速率。同时，利用 Apotracker Green 和 PI 双染色，将细胞分为活细胞、凋亡细胞、死亡细胞和杂质四类，计算出细胞死亡速率。研究发现，三种药物处理都使细胞分裂速率显著下降，YKL-5-124 和 volasertib 处理增加了细胞死亡速率，而 AMG 232 未诱导 HCT116 细胞死亡。此外，通过对野生型 HCT116 和 HCT116^{LIN37-/-/RB-/-}细胞的研究发现，PLK1 抑制剂 volasertib 在 LIN37/DREAM 和 RB 缺陷型细胞中诱导细胞死亡的作用比野生型细胞弱。
• CeDaD 检测法可预测细胞群体生长：由于细胞分裂和死亡是决定细胞群体生长潜力的两个关键参数，研究人员利用 CeDaD 检测法计算细胞数量的变化倍数，结果显示所有处理都使细胞群体生长显著降低，且该方法能检测出不同处理之间的显著差异。与直接细胞计数相比，虽然在高增殖和低凋亡条件下，CeDaD 检测法可能会略微低估细胞群体生长，但总体上二者无显著差异，这证明了 CeDaD 检测法在分析细胞分裂和死亡方面的有效性。
• CeDaD 检测法可推断细胞群体生长：CeDaD 检测法还能预测细胞群体在初始测量期之后的生长情况。以 10^-6M volasertib 处理为例，通过对比 CeDaD 检测法预测的生长曲线和细胞计数得到的生长曲线发现，延长 volasertib 处理时间会产生二次细胞毒性作用，而这种作用仅通过细胞计数数据很难发现。

研究结论和讨论部分指出，CeDaD 检测法是一种非常有价值的工具，它能在小规模细胞培养群体中轻松、同时地评估细胞分裂活性和细胞死亡诱导情况。该方法可以生成细胞群体的指数生长曲线，这在样本量有限的情况下特别有用。此外，它不仅能揭示限制细胞群体生长的不同机制，还可以作为细胞计数的补充工具，帮助研究人员观察到处理或培养条件变化产生的二次效应。

总之，CeDaD 检测法为细胞生物学研究提供了一种创新、高效的研究手段，有助于科研人员更深入地探索细胞分裂和死亡的奥秘，对肿瘤等相关疾病的研究和治疗也具有重要的潜在意义。