巨噬细胞外泌体中的 miR-769-5p：结直肠癌化疗耐药的新 “症结” 与潜在诊疗靶点

研究人员为探究结直肠癌（CRC）化疗耐药机制，研究 GRP78 诱导的巨噬细胞外泌体，发现 miR-769-5p 可促 CRC 干性和耐药，有诊疗意义。

　　结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）作为常见的胃肠道恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。尽管化疗是 CRC 的主要治疗手段之一，但化疗耐药问题却成为了阻碍治疗效果、导致患者预后不良的 “拦路虎”。在癌症的世界里，肿瘤细胞就像一群狡猾的 “敌人”，而化疗药物则是医生手中的 “武器”。一开始，这些 “武器” 能够有效地打击肿瘤细胞，但随着时间的推移，肿瘤细胞逐渐产生耐药性，使得化疗效果大打折扣。目前研究发现，癌症干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是导致化疗耐药的关键因素，抑制癌细胞的干性成为解决这一难题的重要方向。

与此同时，肿瘤并非孤立存在，它所处的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）在肿瘤的发生、发展过程中起着至关重要的作用。TME 就像是肿瘤细胞的 “庇护所”，里面包含了各种免疫细胞、癌细胞相关成纤维细胞、内皮细胞等。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages，TAMs）作为 TME 中数量最多的免疫细胞，主要呈现 M2 型，它们与肿瘤细胞相互勾结，通过释放各种信号分子，帮助肿瘤细胞抵抗治疗。然而，TAMs 与肿瘤细胞之间的具体通信机制，以及它们如何调节肿瘤细胞的干性和化疗耐药性，仍然是未解之谜。

为了揭开这些谜团，山西大学的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上，为结直肠癌的治疗带来了新的希望。

研究人员在本次研究中用到了多种关键技术方法。首先是单细胞测序，通过对结直肠癌单细胞测序数据集（GSE132465）进行分析，对细胞进行注释和聚类，了解不同细胞类型的特征和分布。其次是外泌体提取技术，利用超速离心法从细胞上清液中提取外泌体，并对其进行表征分析。此外，还运用了 qRT-PCR 技术，用于检测基因的表达水平；蛋白质免疫印迹（western blot）技术，检测蛋白质的表达情况；免疫组化（IHC）技术，观察组织中蛋白的表达定位。同时，研究人员还构建了小鼠模型，进行体内实验探究。

研究结果如下：

• GRP78 诱导的巨噬细胞促进 CRC 细胞的化疗耐药和干性：研究人员分析公开的 CRC 单细胞测序数据集发现，M2 巨噬细胞在化疗耐药高风险组中显著富集，且与肿瘤上皮细胞的通信增加。通过实验表明，GRP78 诱导的巨噬细胞条件培养基（GRP78-CM）能显著提高化疗药物 5 - 氟尿嘧啶（5-FU）对 HCT-8 和 DLD1 细胞的半数抑制浓度（IC50）值，降低细胞凋亡率，抑制促凋亡蛋白表达，促进抗凋亡蛋白表达，同时增强 CRC 细胞干性标记物的表达。
• GRP78 诱导的巨噬细胞外泌体调节 CRC 细胞的化疗耐药和干性：研究人员从 GRP78 诱导的巨噬细胞中提取外泌体（GRP78-exos），通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质免疫印迹等方法证实其为外泌体。实验发现，GRP78-exos 能进入 CRC 细胞并发挥作用，显著增加 5-FU 对 CRC 细胞的 IC50 值，削弱 5-FU 对 CRC 细胞的杀伤作用，上调干性标记物的表达。
• GRP78 诱导的巨噬细胞外泌体在小鼠模型中促进化疗耐药：在荷瘤小鼠实验中，给予 GRP78-exos 的小鼠肿瘤体积和重量明显增加，TUNEL 染色显示 GRP78-exos 抑制了 5-FU 对 CRC 细胞的杀伤作用，免疫组化和蛋白质免疫印迹结果表明 GRP78-exos 组小鼠肿瘤组织中结直肠癌干性标记物表达增加。
• 鉴定出 GRP78 诱导的巨噬细胞外泌体中的 miR-769-5p：对 M0 巨噬细胞外泌体（M0-exos）和 GRP78-exos 进行 miRNA 测序分析，发现共有 39 个 miRNA 差异表达，其中 miR-769-5p 在 GRP78-exos 中上调最为显著。
• miR-769-5p 直接从 GRP78 诱导的巨噬细胞通过外泌体转移到 CRC 细胞：实验表明，与 GRP78-exos 共孵育后，CRC 细胞中 miR-769-5p 水平显著增加，且不是内源性合成的结果。进一步实验验证了 miR-769-5p 可通过外泌体从 GRP78 诱导的巨噬细胞转移到 CRC 细胞。
• 源自 GRP78-exos 的 miR-769-5p 增强 CRC 细胞的化疗耐药和干性：通过转染 miR-769-5p 海绵体和模拟物，发现 miR-769-5p 是 GRP78-exos 调节 CRC 细胞化疗耐药和干性的关键因素。
• miR-769-5p 通过靶向 MAPK1 调节化疗耐药和干性：利用生物信息学数据库预测并验证，MAPK1 是 miR-769-5p 的下游靶基因。过表达 MAPK1 可逆转 miR-769-5p 介导的化疗耐药和干性增强作用。
• miR-769-5p 通过下调 MAPK1 诱导 CRC 细胞进入静止期：研究发现 miR-769-5p 可使 CRC 细胞周期阻滞在 G0/G1 期，减少 Edu 阳性细胞，增加 ki-67^lowp27 细胞数量，下调 G1/S 期相关蛋白的表达，而过表达 MAPK1 可抑制这些作用。
• miR-769-5p 在 5-FU 耐药的 CRC 患者中高表达：检测 40 例 CRC 患者肿瘤组织中 miR-769-5p 的表达，发现其在 5-FU 耐药的 CRC 组织中表达更高，且与 MAPK1 表达呈显著负相关。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 GRP78 诱导的 M2 样巨噬细胞通过外泌体中的 miR-769-5p 促进 CRC 细胞干性和化疗耐药的机制。miR-769-5p 通过靶向 MAPK1，抑制细胞周期相关蛋白的表达，促进干性标记物的表达，使 CRC 细胞进入静止期，从而导致化疗耐药。同时，miR-769-5p 在 5-FU 耐药的 CRC 患者中高表达，表明其可能作为 CRC 化疗耐药的预测指标。这一研究丰富了对 miR-769-5p 在癌症中调控作用的认识，为结直肠癌的诊断和治疗提供了新的潜在靶点，有望为克服结直肠癌化疗耐药问题开辟新的道路。