苹果抵御白粉病的免疫平衡调控新机制：WRKY1 的关键作用

为探究 PR1 介导的免疫平衡机制，研究人员研究苹果抵御白粉病机制，发现 WRKY1 调节机制，意义重大。

　　苹果，作为全球广泛种植的水果，在农业经济中占据重要地位。然而，苹果白粉病（Powdery Mildew，PM）却如同一场挥之不去的噩梦，严重威胁着苹果的产量与品质。这种由专性寄生真菌 Podospharea leucotricha 引发的病害，主要侵袭苹果的芽、叶、新梢和幼果，使得果树生长受阻，果实商品价值大打折扣。

在植物的免疫系统中，水杨酸（Salicylic Acid，SA）信号通路宛如一座坚固的堡垒，在抵御生物性病原菌的战斗中发挥着关键作用。SA 能够诱导植物产生一系列防御反应，其中，病程相关蛋白 1（Pathogenesis-related 1，PR1）便是防御体系中的重要一员。PR1 蛋白的积累可以增强植物对病原菌的抵抗力，但物极必反，过量的 PR1 积累会对植物自身造成损害。目前，PR1 介导的免疫平衡机制仍如同迷雾，亟待科学家们去揭开其神秘的面纱。

为了深入探究这一机制，南京农业大学园艺学院以及贵州省农业科学院果树研究所的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Molecular Horticulture》杂志上，为我们理解苹果抵御白粉病的机制提供了全新的视角。

研究人员在研究过程中运用了多种技术方法。通过 DNA 亲和纯化测序（DAP-seq）技术，他们能够在全基因组范围内精准定位转录因子的结合位点，从而筛选出潜在的靶基因。酵母杂交实验（包括酵母单杂交 Y1H、酵母双杂交 Y2H 和酵母三杂交 Y3H）则帮助他们验证了蛋白质与 DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。此外，电泳迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶报告基因检测（Dual-luciferase assay）、GST-pulldown 实验和双分子荧光互补实验（BiFc）等技术，从不同角度为研究提供了有力的数据支持。在植物材料方面，研究人员对苹果组织培养苗进行白粉菌接种和 SA 处理，并对转基因植物进行遗传转化和鉴定，通过这些实验操作来观察相关基因的表达变化和蛋白的功能。

研究结果如下：

1. 揭示 PM 感染后调控 SA 介导免疫平衡的机制：研究人员对接种 PM 病原菌的苹果组织培养苗进行研究，检测 SA 生物合成基因的表达、内源性 SA 水平以及 PR1 基因的表达。结果发现，PM 感染后，SA 合成基因如 ICS1、EDS5-1、EDS5-2 和 PBS3 显著上调，内源性 SA 水平在 24 小时内逐渐升高，然而 PR1 表达却在 6 小时达到峰值后下降，24 小时时恢复到基础水平。这一现象表明，存在一种调控机制，通过调节 PR1 水平来维持 SA 介导的免疫平衡。
2. 转录因子 WRKY40 参与调控 PR1 基因表达：研究人员在前期研究中发现了 6 个对 PM 感染有响应的 WRKY 转录因子，其中 WRKY40 基因在 PM 挑战后表达上调最为显著。通过对 WRKY40 蛋白水平的检测以及对其与 PR1 基因表达相关性的分析，发现 WRKY40 可能参与调控 PR1 基因表达。进一步构建 WRKY40 基因沉默和过表达的转基因植物，结果显示，沉默 WRKY40 基因可降低叶片表面的病原菌载量，而过表达则增加病原菌载量，表明 WRKY40 是 PM 抗性的负调控因子。
3. 鉴定 WRKY40 的结合位点和靶基因：利用 DAP-seq 技术，研究人员发现 WRKY40 的结合峰主要位于启动子或基因间区域，并且其结合位点存在显著富集的 W-box 基序。通过 EMSA 实验证实 WRKY40 能够特异性结合 W-box 基序，KEGG 通路分析表明 WRKY40 的靶基因富集在激素信号和植物 - 病原菌互作通路，说明 WRKY40 通过与 W-box 元件相互作用来调节参与激素介导的植物 - 病原菌反应的基因。
4. NPR3g 负调控 PM 抗性并抑制 PR1 表达：以 AtNPR3/4 为模板在苹果基因组中进行同源比对，发现 7 个 NPR3/4-like 基因，其中 NPR3g 被证实是 WRKY40 的直接转录靶标。通过 Y1H、EMSA、LUC 等实验验证了 WRKY40 对 NPR3g 表达的正向调控作用。构建 NPR3g 基因沉默和过表达的转基因植物，结果表明 NPR3g 通过抑制 PR1 表达来负调控 PM 抗性。
5. NPR3g 与 NPR1 相互作用调节 NPR1 活性：结构分析显示 NPR3g 含有 BTB/POZ 结构域，而 NPR1 包含 BTB/POZ、Ank2 和 NPR1-like 结构域。Y2H、GST-pulldown 和 BiFc 实验表明，NPR3g 与 NPR1 的相互作用受 SA 调节，并且 NPR3g 特异性结合 NPR1 的 BTB/POZ 结构域，说明 SA 结合可能触发 NPR1 的构象变化，使其 BTB/POZ 结构域能够与 NPR3g 相互作用。
6. TGA2c-2 促进 PR1 表达：研究人员在苹果基因组中鉴定出 6 个 TGA2/5/6-like 基因，其中 TGA2c 存在两种转录本：TGA2c-1 和 TGA2c-2。Y2H、GST-pulldown 和 BiFc 实验表明，SA 不影响 NPR1 与 TGA2c-1 的相互作用，但对 NPR1 与 TGA2c-2 的相互作用至关重要。过表达 TGA2c-1 和 TGA2c-2 的植物中 PR1 表达显著上调，说明这两种转录本均正向调节 PR1 基因表达。
7. NPR3g 抑制 PR1 表达的机制：通过 Y3H、GST-pulldown 和 BiFc 实验发现，NPR3g 在 SA 存在的条件下能够抑制 NPR1 与 TGA2c-2 的相互作用，从而抑制 PR1 表达。有趣的是，在无 SA 的条件下，NPR3g 能够增强 NPR1 与 TGA2c-2 的相互作用。研究人员推测 NPR3g 通过竞争 NPR1 的 BTB/POZ 结构域来抑制 PR1 表达。
8. WRKY1 调节 WRKY40-NPR3g 模块并增强 SA 生物合成：研究发现 WRKY1 是 WRKY40 和 NPR3g 的上游调节因子，通过 Y1H、EMSA、LUC 等实验证实 WRKY1 能够特异性结合 WRKY40 和 NPR3g 的启动子，正向调节它们的表达，从而抑制 PR1 水平。此外，WRKY1 还能够通过正向调节 EPS1 基因来增强 SA 生物合成，进而提高苹果对 PM 的抗性。

研究结论与讨论部分指出，本研究揭示了一个全新的由 WRKY1 介导的调节 PR1 介导的免疫平衡的机制。在 PM 感染初期，WRKY1 通过促进 EPS1 基因表达来增加 SA 积累，启动 PR1 蛋白的产生，增强植物的防御能力。随着 PM 感染的持续，SA 不断积累，为了避免 PR1 蛋白过度积累对植物造成损害，WRKY1 激活 WRKY40-NPR3g 模块，抑制 PR1 表达。这一机制的发现，为我们深入理解植物免疫平衡的调控提供了重要依据，也为培育抗病植物品种奠定了理论基础。未来，研究人员可以基于这一机制，进一步探索通过基因工程手段提高植物抗病性的方法，有望为农业生产带来新的突破，让苹果等作物能够更好地抵御白粉病等病害的侵袭，保障农产品的产量和质量。