综述：纳米颗粒向肿瘤递送的非 EPR 依赖途径

本文综述了纳米颗粒（NPs）向肿瘤递送的多种途径，探讨非 EPR 依赖机制在肿瘤治疗中的作用。

　　

1. 引言

纳米颗粒（NPs）作为一种多功能工具，在恶性组织的靶向药物递送和成像方面具有重要应用。它能携带化疗药物和生物大分子，提高药物生物利用度，还可经工程化设计，对肿瘤微环境中的刺激作出响应，实现选择性药物释放。此外，通过修饰靶向配体，NPs 能精准作用于肿瘤细胞，降低对健康组织的毒性。

过去，NPs 在体内的递送主要依赖 “增强渗透滞留”（EPR）效应，即 NPs 通过肿瘤异常渗漏的血管积累，并因淋巴引流受损而滞留。然而，基于 EPR 效应的纳米药物在临床转化中面临挑战，主要原因是 EPR 效应存在显著异质性，受肿瘤血管密度、细胞间隙大小、血栓形成等多种因素影响。这使得研究人员开始探索其他能增强 NPs 在肿瘤中积累的机制。

活体显微镜（IVM）技术的发展为研究 NPs 在肿瘤中的递送提供了有力工具。它能在细胞水平实时观察 NPs 在活体动物中的行为，揭示了除 EPR 效应外的多种运输机制，如靶向肿瘤血管、细胞介导的递送等，为纳米药物设计提供了新视角。

2. EPR 效应在临床前和临床研究中的应用

2.1 EPR 效应在纳米颗粒递送中的现象

EPR 效应的发现推动了纳米材料的设计，目前已有 60 多种纳米药物获批临床使用。在多种动物模型以及人类部分癌症（如结直肠癌、乳腺癌等）中，都观察到 NPs 通过 EPR 效应在肿瘤组织中的积累。

EPR 效应的机制主要包括两个方面：一是肿瘤血管内皮细胞间存在病理开口，使得 NPs 能够通过这些开口进入肿瘤组织。研究发现，MCa-IV 小鼠乳腺癌血管中，14% 的血管表面细胞连接不良，内皮细胞间开口中位大小为 1.5μm，跨细胞孔中位大小为 0.6μm 。此外，肿瘤血管的孔径存在差异，多数肿瘤的血管截留孔径在 380nm - 780nm 之间，这限制了 NPs 的大小设计，一般认为 10 - 200nm 的 NPs 适合在实体肿瘤中被动积累。二是肿瘤组织的淋巴引流受损，导致 NPs 在肿瘤组织中长时间滞留。不过，近期研究表明，肿瘤淋巴管并非完全塌陷，且 NP 的清除与大小有关，大颗粒清除较少。

为了最大化肿瘤积累，基于 EPR 效应的 NPs 设计有诸多限制，如控制 NPs 大小以避免肾清除和巨噬细胞摄取，修饰表面化学以减少与其他细胞的相互作用等。但随着对 NPs 渗透机制的深入研究，发现除 EPR 效应外还有其他替代机制，这可能会减少对 NPs 工程设计的限制。

2.2 EPR 效应在临床转化中的挑战

尽管在临床前研究中，许多 NPs 在治疗实体肿瘤方面表现出有效性，但在临床试验中却效果有限。例如，脂质体阿霉素虽能降低心脏毒性，但在提高客观缓解率和无进展生存期方面效果不佳；BIND - 014 多聚体纳米颗粒在治疗转移性前列腺癌时，也未显示出比标准疗法更显著的优势。

这些挑战主要源于小鼠肿瘤模型与临床样本的差异。人类肿瘤通常更大，基因模式更复杂，血管化和间质微环境存在显著异质性。此外，人类肿瘤的血流常受抑制，血管易堵塞，肿瘤大小也会影响 EPR 效应。肿瘤内部的高间质液压力（IFP）、癌细胞的密集增殖以及细胞外基质（ECM）的沉积，都阻碍了 NPs 在肿瘤内的均匀分布和渗透。

肿瘤微环境（TME）中的其他成分，如基质细胞、免疫细胞等，也会影响 EPR 效应。TME 的缺氧、酸性环境以及其成分的异质性，导致纳米药物在肿瘤内的分布不均匀。

IVM 技术可用于研究 TME 的物理参数，为药物递送提供重要信息。通过 IVM 观察发现，患者肿瘤血管紊乱，部分血管无血流。此外，IVM 还可用于监测 NPs 行为，预测药物积累和治疗反应。个性化医疗概念的实施，如在治疗前分析 TME 特征和 EPR 积累情况，有助于克服 EPR 效应在临床转化中的挑战。

3. 非 EPR 依赖的纳米颗粒递送机制

NPs 在某些肿瘤类型或区域的增强积累促使人们对其递送机制进行深入研究。IVM 研究揭示，免疫细胞和内皮细胞在 NPs 的递送和保留中发挥着积极作用，存在多种运输机制，且不同肿瘤类型或微环境中的主导途径尚待确定。

3.1 血管内靶向和药物释放的方法

• 肿瘤血管内的药物释放：传统观点认为，NPs 需穿过肿瘤血管内皮才能发挥治疗作用，但研究发现，在某些情况下，将 NPs “尽可能靠近” 肿瘤递送也能实现有效治疗。例如，Miller 等人的研究表明，即使 NPs 未穿过血管壁，其释放的有效载荷也能在 30 分钟内渗透到肿瘤组织中。

基于此，一种新的药物递送概念 —— 内皮快速释放（FlaRE）应运而生。该方法通过将载药 NPs 快速递送至肿瘤血管并使其在血管内快速降解，释放的药物在血管内形成高浓度，驱动药物沿浓度梯度扩散到肿瘤间质，从而发挥治疗作用。理论研究显示，与缓慢释放的 NPs 相比，快速释放的 NPs 能在远处恶性细胞中达到更高的药物浓度峰值，更有利于治疗。

多种外部刺激，如热、光、X 射线、超声等，可用于触发 NPs 在血管内的药物释放。例如，热激活脂质体可在热刺激下快速释放药物，提高药物渗透距离和癌细胞暴露时间；近红外光激活的脂质体，通过光照射诱导单线态氧介导的脂质氧化来释放药物；超声不仅能触发药物释放，还能破坏肿瘤血管，增强药物递送效果，甚至可作为癌症的单一疗法。目前，具有血管内药物释放功能的脂质体已进入临床试验阶段，如 ThermoDox 的 I 期试验证明了其安全性和有效性。

IVM 可用于实时验证不同的血管内药物递送方法，为确定具有肿瘤血管首过积累和快速药物释放特性的材料提供了重要手段。

• 主动靶向肿瘤血管受体：药物在血管内快速释放的递送概念可通过将载药 NPs 快速结合到肿瘤内皮细胞上而受益。肿瘤内皮细胞表达多种肿瘤内皮标记物（TEM），这些标记物可作为 NPs 的靶向分子。然而，并非所有标记物都具有内皮特异性，部分标记物在其他细胞类型或心血管疾病时也会表达，可能导致非特异性靶向。

B7 - H3（CD276）是一种在肿瘤内皮细胞和多种肿瘤细胞上高表达的跨膜蛋白，其高表达与患者低生存率相关。以 CD276 为靶点的 NPs 和药物偶联物在肿瘤治疗中显示出良好效果，能促进肿瘤递送并破坏肿瘤细胞和血管。

4 - 1BB（CD137）属于肿瘤坏死因子受体家族，在肿瘤内皮细胞上表达，可促进 T 细胞的细胞毒性，增强肿瘤免疫治疗效果。但由于其在炎症性动脉粥样硬化病变中也存在，未来靶向 CD137 的治疗需考虑潜在的脱靶效应。

TEM1、TEM5、TEM7 和 TEM8 等是在肿瘤血管中上调的基因编码的细胞表面蛋白，虽并非肿瘤特异性，但在成人中主要局限于肿瘤内皮细胞，是潜在的肿瘤血管靶向靶点。

基质金属蛋白酶（MMPs）与肿瘤血管生成密切相关，修饰 NPs 表面使其对 MMPs 敏感，可增强药物向肿瘤的递送，改善肿瘤治疗效果。

此外，一些细胞黏附分子（CAMs），如 VCAM - 1、ICAM - 1 等，在肿瘤血管中表达上调，可作为分子靶点。RGD 肽修饰的 NPs 能特异性结合整合素，促进 NPs 在肿瘤中的积累和药物递送。

• 纳米颗粒的被动靶向肿瘤血管设计：除了主动靶向，NPs 还可设计为在肿瘤血管中被动积累。肿瘤血管的血流阻力高，血流速度慢，亚微米尺寸的 NPs 可因增强的剪切应力而在肿瘤内皮中递送和保留，有利于血管内快速药物释放的递送概念。

NPs 的形状和大小对其在肿瘤血管中的行为有显著影响。理论和实验研究表明，盘状 NPs 在肿瘤血管中的边缘化和黏附能力较强，更易与血管壁接触并黏附，且循环时间较长。此外，NPs 的机械性能也会影响其在肿瘤血管中的行为，刚性颗粒更易边缘化，而软性颗粒与免疫细胞和巨噬细胞的相互作用较弱，血液循环时间更长，且在某些情况下更易渗透肿瘤。

模仿体内自然解决方案是靶向特定部位的有效方法。外泌体或细胞衍生的纳米囊泡（MDNs）具有肿瘤归巢特性，可用于药物递送。例如，中性粒细胞、红细胞、间充质干细胞等来源的 MDNs 能特异性靶向肿瘤组织。此外，用细胞膜修饰 NPs，可提高其在肿瘤血管中的积累和治疗效果，但需注意可能存在的脱靶效应。

3.2 细胞介导的纳米颗粒递送

在 EPR 范式中，许多隐形 NPs 旨在避免非靶向相互作用，但血液中的多种细胞可增强 NPs 向肿瘤的递送。免疫细胞如中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞可通过趋化作用迁移到炎症组织，巨噬细胞在肿瘤晚期可占肿瘤质量的一半。NPs 可利用这些细胞的自然运输途径，通过锚定在细胞表面或被细胞摄取的方式穿越内皮屏障。此外，免疫细胞穿越血管屏障时可诱导微渗漏，促进非结合 NPs 的递送。

• 中性粒细胞介导的递送：中性粒细胞是循环白细胞的主要群体，在炎症和肿瘤浸润中发挥重要作用。其招募受 CXC 趋化因子调节，通过一系列过程穿越内皮屏障进入肿瘤组织。

中性粒细胞能增强 NPs 的递送，在迁移过程中可诱导内皮壁渗漏，促进 NPs 从循环中逸出，还能突破肿瘤血管基底膜，使 NPs 更深入地渗透到肿瘤中。中性粒细胞可摄取多种纳米材料，这既会改变其自身和 NPs 的药代动力学性质，也能作为 NPs 的运输载体，将 NPs 从血管运输到肿瘤间质。例如，用抗 CD11b 抗体靶向激活的中性粒细胞，可显著提高金纳米棒向肿瘤的递送。

然而，利用中性粒细胞递送 NPs 也面临一些挑战，如中性粒细胞寿命短、提取和输注可能带来不良反应等。但在小鼠实验中，用负载化疗药物的中性粒细胞治疗癌症，效果优于标准的中性粒细胞输注或 NP 给药。

• 单核细胞和巨噬细胞介导的递送：单核细胞是先天免疫系统的关键细胞，可分化为巨噬细胞和树突状细胞。单核细胞可摄取 NPs 并将其运输到炎症部位，分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）后，可作为药物储存库，将 NPs 释放到邻近肿瘤细胞。

研究表明，髓细胞介导的脂质纳米载体向炎症组织的递送占比可达 50 - 60%。PEG 化虽可减少 MPS 细胞对 NPs 的摄取，但会延长血液循环时间，增加髓细胞对 NPs 的摄取。通过设计单核细胞结合适配体或修饰 NPs 使其能被单核细胞表面受体识别，可提高 NPs 向肿瘤的递送。

TAMs 在肿瘤间质中可主动运输 NPs，其运输能力与 NP 大小有关，较大的 NPs 运输效果更好。但巨噬细胞摄取 NPs 后，NPs 可能被降解，因此这种运输方式更适合递送前药或可被外部刺激激活的 NPs。

• 淋巴细胞介导的递送：EPR 效应的异质性使得治疗高度转移性疾病和血管生成不良的肿瘤具有挑战性。淋巴细胞，如 T 细胞，具有优化的迁移和归巢能力，可作为 NPs 的运输载体。

Huang 等人将自体多克隆 T 细胞在体外扩增并使其具有向淋巴器官归巢的能力，然后将 NPs 附着在其表面，结果显示 NPs 在淋巴结中的浓度显著增加，携带的抗淋巴瘤药物在淋巴器官中的积累也明显提高。

T 细胞还可用于向其他肿瘤类型递送纳米治疗药物。例如，将负载细胞因子的脂质 NPs 与 CD8 + T 细胞结合，可提高药物向黑色素瘤的递送，促进 T 细胞扩增，增强肿瘤根除效果。此外，通过将纳米凝胶与 T 细胞的 CD45 受体结合，可实现 T 细胞受体激活时纳米凝胶药物的选择性释放，提高肿瘤治疗效果。

• 红细胞介导的递送：红细胞（RBCs）是一种灵活的运输载体，循环时间长。虽然 RBCs 通常不会穿过内皮壁，但可通过在毛细血管中受剪切应力作用释放 NPs，将 NPs 运输到某些器官的内皮壁。

研究表明，静脉输注与 RBCs 结合的 NPs 可显著提高 NPs 向肺部的递送，用于治疗肺部转移瘤。例如，用 RBCs 递送载药纳米颗粒，可有效抑制肺部转移瘤的生长，提高小鼠生存率。此外，RBCs 还可与某些 NPs 相互作用，将其运输到非肺部肿瘤类型，为癌症治疗提供了更广泛的应用前景。

3.3 纳米颗粒的跨内皮渗透

• 血管喷发：在经典的 EPR 范式中，肿瘤周围血管的静态间隙被认为是 NPs 运输的主要途径，但近年来研究发现，一些内皮开口具有随机和短暂的行为，即动态孔隙。这些动态孔隙可使 NPs 在压力梯度的作用下深入肿瘤间质，形成羽流状的扩散前沿。

动态孔隙对 NP 外渗的影响与颗粒大小有关，较大的 NPs 可产生更大、更持久的喷发羽流。研究表明，动态孔隙的直径可达至少 625nm，能使亚 300nm 的颗粒甚至血小板通过。动态孔隙与静态孔隙共存，是临床批准的脂质体纳米药物 Doxil（85nm）外渗的主要机制，这促使人们重新思考和优化基于 EPR 模型的 NP 设计策略。

动态孔隙的形成与肿瘤组织中免疫细胞的招募和基底膜的损伤有关。中性粒细胞和单核细胞的浸润可诱导 NP 渗漏，低剂量辐射治疗可促进巨噬细胞招募，触发血管喷发，增强肿瘤对 NPs 的摄取。此外，抑制 TGF_β或诱导局部热疗可增加动态孔隙的频率和面积，促进 NPs 外渗，但也有研究未发现免疫细胞与 NP 喷发之间的明确关联。

• 通过肿瘤血管的转胞吞作用：转胞吞作用是一种主动的细胞过程，可使 NPs 穿过内皮细胞。与 EPR 效应等被动递送机制不同，转胞吞作用利用细胞机制，使 NPs 能够通过细胞内囊泡、囊泡 - 空泡细胞器和薄窗孔等结构进行运输。

研究发现，肿瘤血管内皮细胞中存在多种促进转胞吞作用的结构，如间隙、空泡和窗孔等，且肿瘤患者的肿瘤血管表达与转胞吞作用相关的蛋白质。IVM 可用于观察 NPs 的转胞吞过程，通过分析 NPs 与内皮细胞的信号共定位，可捕捉 NPs 外渗的动态过程。

多种机制可诱导 NPs 的转胞吞作用，如小窝介导的摄取、网格蛋白介导的内吞作用等。小窝介导的摄取是大分子转胞吞的主要起始途径，尤其对于表面带有白蛋白的 NPs；网格蛋白介导的内吞作用则主要负责某些功能性 NPs 的摄取。此外，还有其他受体依赖和非依赖的内吞机制也参与血管转胞吞作用。

NPs 的跨内皮运输主要发生在肿瘤血管中一种特殊的内皮细胞亚群 ——NP 运输内皮细胞（N - TECs）中。N - TECs 仅占肿瘤内皮细胞的 21%，但高表达与纳米颗粒积累相关的蛋白，其参与 NP 转胞吞作用已得到证实。

另一种转胞吞途径是通过肿瘤内皮细胞的囊泡 - 空泡细胞器（VVOs）网络运输 NPs。VVOs 可连接细胞的腔面和基底侧，在多种肿瘤模型中均有观察到。刺激肿瘤内皮细胞可增加 VVO 的形成，促进 NPs 的转胞吞作用，提高 NPs 在肿瘤中的摄取。

修饰 NPs 的表面性质可改善其转胞吞作用。例如，在两性离子胶束表面呈现阳离子基团可增强小窝介导的内吞作用；在 NPs 表面提供白蛋白部分可提高其肿瘤内递送效率。此外，调节血管生成也可影响 NPs 的转胞吞作用，如沉默血管内皮生长因子受体 2（VEGFR2）可增强某些肿瘤中 NPs 的摄取，但该方法可能仅对特定类型的 “血管丰富” 癌症有效。

4. 用于纳米颗粒运输分析的 IVM 技术发展

IVM 技术是研究肿瘤微环境（TME）、可视化 NP 运输及其与细胞相互作用的重要工具。早期对 EPR 效应的研究通过光学分析 Evans blue - albumin 复合物在肿瘤中的积累来证明其存在，但这种方法只能提供有限的信息。IVM 技术则能动态观察 NPs 的积累过程，评估其在不同肿瘤区域的异质性。

然而，生物组织对光的散射和吸收限制了 IVM 技术的应用，使其只能观察肿瘤表面的血管。多光子显微镜通过利用非线性光学效应和近红外（NIR）激发，可提高成像深度，结合在短波红外区域吸收和发射光的 NPs，成像深度可达近 1mm 。

成像窗口技术的引入为研究深部肿瘤提供了帮助。如背窗室技术可用于长期观察皮下肿瘤和内部器官中 NP 的运输，但可能影响肿瘤生长和组织灌注；灌注窗室则可用于研究局部给药后的药物运输。光学组织清除技术可减少组织对光的散射，无需成像室即可<观察腹部器官，为研究 np>

针对原位肿瘤的研究，IVM 技术面临挑战，因为原位肿瘤的微环境更复杂，传统显微镜系统难以清晰成像。不过，通过开发器官特异性成像窗口和提高显微镜的信噪比，可实现对原位肿瘤中 NP 递送的分析，如利用透明颅窗的活体双光子显微镜可研究脑胶质瘤中 NP 的递送。

先进的荧光成像工具可深入研究 NP 与细胞在体内的复杂动态相互作用。荧光寿命成像显微镜（FLIM）能基于荧光团寿命的变化提供其与周围环境相互作用的信息，可用于监测药物在肿瘤细胞中的嵌入、NPs 及其有效载荷的亚细胞定位等。

然而，IVM 技术也存在局限性，如难以在器官水平捕捉 NPs 的积累，荧光信号易受微环境影响等。结合全身荧光成像、核成像技术（如单光子发射计算机断层扫描 SPECT 和正电子发射断层扫描 PET）可更全面地了解 NP 的递送情况。

未来，人工智能工具的应用有望进一步提升 IVM 技术的分析能力。深度学习算法可改善深层组织图像的信噪比，机器学习算法能处理大量医学数据，对 NP 运输机制进行大规模量化分析，有助于解决纳米药物在临床样本中积累的异质性问题。此外，将 IVM 技术应用于临床，验证不同 NP 运输机制，对指导肿瘤分层和治疗方案选择具有重要意义。目前，术中 IVM 技术和共聚焦激光内镜显微镜已在临床中应用，未来需进一步提高其空间分辨率。

5. 结论

IVM 技术的应用使人们对 NP 运输机制的认识不断深化，从最初认为主要依赖 EPR 效应，到发现多种非 EPR 依赖的途径，如 EPR 效应的动态特性、免疫血细胞参与 NP 运输以及 N - TECs 介导的主动转胞吞作用等。但目前这些机制大多在动物异种移植模型中观察到，与人类肿瘤的实际情况存在差异。患者来源的异种移植模型或由患者来源细胞培养的肿瘤模型，可能更能反映人类肿瘤的特征，IVM 技术可用于评估这些模型的准确性，同时利用先进的荧光细胞传感器可精确评估组织异质性。

在临床中，基于 EPR 设计的纳米材料积累存在显著异质性，新发现的主动 NP 运输途径可能也存在同样问题。免疫细胞浸润水平在不同患者间差异较大，能进行 NP 转胞吞的内皮细胞在肿瘤血管中的分布也不均匀。因此，评估不同机制对 NP 整体运输的贡献，以及预测肿瘤对不同治疗方案的反应至关重要。目前已提出使用伴随诊断纳米剂评估基于 EPR 效应的纳米载体被动积累，未来还需开发针对主动 NP 运输机制的选择性示踪剂。

此外，如果 EPR 效应不是 NP 递送的唯一机制，那么基于其设计纳米药物的限制需要重新评估。例如，隐形涂层虽能延长 NPs 的循环时间，但可能影响其与内皮细胞、中性粒细胞和血液单核细胞的相互作用，限制主动运输。研究发现，通过高剂量注射 NPs 或预阻断 MPS 等方法，可不依赖隐形涂层实现较长的循环时间。同时，NP 的大小、形状、刚性和功能修饰等物理化学性质对不同递送机制的效率有重要影响，需要进一步深入研究，以确定最佳的 NP 设计，提高肿瘤治疗效果。