《Cell Stem Cell》综述：Epiregulin 促进人多能干细胞来源的肠道类器官分化并具有类似人体的组织和功能

　　

### 一、研究背景
人肠道类器官（Human intestinal organoids，HIOs）源自诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），是模拟人类肠道的三维（3D）结构，在研究人类发育、生理学和病理生理学方面意义重大。与患者来源的类器官不同，HIOs 包含多种组织谱系的细胞，但体外培养的 HIOs 结构简单，缺乏神经元、内皮细胞和有组织的平滑肌等重要细胞类型，这限制了其功能的重现和转化应用潜力。此前虽有多种方法尝试增加 HIOs 的复杂性，如共培养、移植或改变生长因子等，但尚无单一、统一的方法实现多种细胞谱系在同一类器官中的协调分化。

二、研究目的

本研究旨在利用表皮调节蛋白（EPIREGULIN，EREG）这一在人类肠道发育中重要的干细胞龛因子，探究其对 iPSC 来源的 HIOs 分化的影响，构建更复杂、功能更完善的 HIOs 模型，为肠道相关研究和治疗提供有力工具。

三、研究方法

1. HIOs 的制备与培养：采用已有的成熟方法，从人 iPSCs 诱导分化生成 HIOs。在分化过程中，将收集的球体嵌入基质胶（Matrigel），先用含表皮生长因子（EGF）、头蛋白（NOGGIN）和 R - 脊椎蛋白 1（RSPONDIN - 1，ENR Media）的培养基培养 3 天，之后分别用不同浓度（1、10 和 100 ng/mL）的 EREG 或 EGF 培养基培养，对比观察 HIOs 的形成效率、形态特征及细胞分化情况。

2. 细胞分析技术：运用单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）、单细胞核 RNA 测序（snRNA - seq）、逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）、免疫荧光染色（IF）、流式细胞术等技术，对不同培养条件下 HIOs 中的细胞类型、基因表达、蛋白表达及细胞比例进行检测和分析。

3. 动物实验：将体外培养 28 天以上的 HIOs 移植到免疫缺陷的 NOD - scid IL2Rg 敲除（NSG）小鼠的肾包膜下，使其进一步成熟。通过 IF 染色、snRNA - seq 等方法评估移植后 HIOs（tHIOs）的细胞组成、组织学特征和功能。

4. 功能测试实验：对 tHIOs 进行肌肉收缩和肠神经系统（enteric nervous system，ENS）功能测试，通过器官浴实验观察其在不同刺激和抑制剂作用下的收缩反应；利用微流控装置和体内移植实验，检测 HIOs 内皮细胞形成功能性血管的能力。

四、研究结果

1. 含多种细胞类型的 HIOs 的生成：在不同浓度 EREG 培养条件下，HIOs 形成效率与 EGF 对照组相比差异不大，且形态相似。scRNA - seq 分析发现，10 ng/mL EREG 培养的 HIOs 中，存在富含平滑肌基因的细胞簇以及多个具有神经胶质身份的细胞簇，该条件下 HIOs 的神经细胞类型最为多样。RT - qPCR 和免疫荧光染色进一步证实，与 EGF 培养的 HIOs 相比，EREG 培养的 HIOs 中神经元、平滑肌和内皮细胞的分化增强。时间进程实验表明，EREG 促进多种细胞类型分化，但长时间培养会导致这些细胞群体减少。磷酸激酶筛选实验显示，EREG 和 EGF 虽都能刺激表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化，但引发的细胞内反应不同。

2. EREG - HIOs 移植后的成熟与细胞组织化：将 10 ng/mL EREG 或 EGF 培养的 HIOs 移植到小鼠肾包膜下 12 周后，IF 染色显示，EREG - tHIOs 中含有丰富的神经元和内皮细胞，且空间组织类似人类肠道，而 EGF - tHIOs 中则很少。snRNA - seq 分析及标签转移实验证实，EREG - tHIOs 中的细胞类型与人类胎儿肠道细胞具有相似的转录状态。

3. EREG - tHIOs 的蠕动样功能：器官浴实验中，EREG - tHIOs 在无刺激时能自发产生节律性收缩，而 EGF - tHIOs 则无此现象。EREG - tHIOs 对毒蕈碱受体激动剂贝胆碱（bethanechol）的刺激呈剂量依赖性收缩反应，对毒蕈碱拮抗剂东莨菪碱（scopolamine）则产生明显的肌肉松弛反应。此外，通过对神经元的刺激和抑制实验表明，EREG - tHIOs 中的神经元和胆碱能神经元能引发平滑肌收缩，证明其具备功能性的神经肌肉单元。

4. EREG - HIOs 功能性血管的形成：免疫荧光染色显示，EREG - HIOs 中存在大量内皮细胞网络，而 EGF - HIOs 中则很少见。体内移植实验发现，EREG - tHIOs 的内皮细胞能与宿主循环系统吻合，形成功能性血管，且在微流控装置实验中，EREG - HIOs 能与重置血管内皮细胞（RVECs）相互作用，形成可灌注的血管样结构，而 EGF - HIOs 则不能。

五、研究讨论

本研究利用发育中的人类肠道信息，确定了发育龛因子 EREG，成功构建了增强的 hPSC 来源的 HIO 模型。该模型可同时形成上皮、间充质 / 基质、神经、内皮和平滑肌细胞群体，移植后能进一步成熟并展现功能活性。与其他复杂组织生成方法相比，本研究方法利用内源性信号诱导类器官内复杂细胞类型的形成，更准确地再现了肠道发育过程，使内皮细胞等细胞类型与其他关键细胞谱系协同发育，从而实现细胞功能。然而，本研究仍存在局限性，如 HIOs 中仍缺少免疫和淋巴谱系等细胞类型，且对 EREG 和 EGF 在培养系统及人类肠道发育中精确的机制差异理解不足。未来需进一步探索这些信号差异，并补充缺失的细胞群体，以充分了解该系统的能力。

六、研究意义

本研究成果在转化医学和再生医学领域具有重要意义。这种增强的 HIO 模型系统为研究肠道运动障碍、神经源性和肌源性功能障碍（如先天性巨结肠、肠闭锁和狭窄）、药物诱导的运动障碍等复杂肠道病理生理学提供了平台，有助于深入理解人类肠道发育、疾病建模、药物筛选和个性化医学，推动相关领域的研究进展。