磁性 Janus 水凝胶微机器人促进肩袖撕裂重建手术中肌腱 - 骨界面梯度再生

本文开发磁性 Janus 水凝胶微机器人，用于肩袖撕裂（RCT）重建手术，可促进肌腱 - 骨界面（TBI）愈合。

　　

一、肩袖撕裂修复的挑战与研究背景

肩袖撕裂（Rotator cuff tear，RCT）是导致肩关节残疾的主要原因，在老年人群中尤为普遍。普通人群中全层 RCT 的发病率超过 20%，80 岁及以上人群中这一比例甚至超过 50%。由于肩袖自身愈合能力有限，RCT 后常需进行重建手术以恢复其结构完整性，改善患者临床预后。然而，尽管手术技术和术后康复不断改进，RCT 重建的失败率仍高达 20%-70%，主要原因是手术干预后肌腱 - 骨界面（Tendon-bone interface，TBI）愈合不良。

TBI 是一种跨越亚毫米尺度的分层过渡组织，其成分、细胞表型和结构从肌腱到骨存在自然梯度。例如，TBI 中矿物质（如 Ca²⁺、Mg²⁺和 Zn²⁺）含量的变化构成了自然成分梯度；骨组织主要由骨间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）分化的终末细胞组成，而肌腱组织富含活跃的肌腱细胞（Tenocytes，TCs），这体现了细胞表型梯度；此外，从高度有序的肌腱胶原纤维到排列较疏松的骨胶原纤维，其取向的逐渐变化形成了结构梯度。其中，矿物质含量梯度在细胞表型梯度的形成和维持中起关键作用，进而影响 TBI 中肌腱 - 骨过渡结构的形成和重建。因此，开发有效策略重建 TBI 中的这些梯度，是提高 TBI 愈合效果的关键挑战。

生物活性金属离子在组织再生中具有重要作用，不同组织中各种生物活性金属离子的含量存在差异，它们在维持组织正常生理功能和促进组织再生过程中发挥着特定作用。研究发现，人体骨组织中 Mg²⁺/Zn²⁺比值明显高于肌腱组织，表明 TBI 中存在自然的 Mg²⁺/Zn²⁺梯度。Mg²⁺是人体必需元素，主要存在于骨骼系统中，在骨发育、代谢和再生中起关键作用，它可通过促进 BMSCs 的增殖、积累和向成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性，以及调节甲状旁腺激素和维生素 D 的代谢和功能，加速骨再生。Zn²⁺在肌腱和肌肉中含量丰富，是许多参与胶原蛋白代谢和组织再生的转录因子和酶系统的辅助因子，它能刺激 TCs 增殖、积累和促进肌腱生成相关功能，增加受伤肌腱组织中 I 型胶原蛋白（COL-I）的含量，同时抑制 III 型胶原蛋白（COL-III）的合成和积累，从而加速肌腱修复过程。尽管 Mg²⁺和 Zn²⁺分别被证明可促进骨和肌腱再生，但由于 TBI 中存在自然的 Mg²⁺/Zn²⁺梯度，如何有效结合这两种离子实现令人满意的 TBI 修复仍是一个重大挑战。

此前研究尝试通过模塑或 3D（生物）打印方法制备具有离子、生长因子、细胞或基质梯度的双层或三层水凝胶来重建 TBI 的梯度，但这些水凝胶在 RCT 重建中的应用效果并不理想。这主要是因为 RCT 重建手术多采用微创手术和内窥镜，使得这些结构复杂且不可注射的水凝胶难以植入，同时在手术中和术后调整其方向以匹配 TBI 的梯度也非常困难。因此，开发更有效、适用的生物材料，在 RCT 重建手术中重建 TBI 的自然矿物成分梯度，是当前亟待解决且极具挑战性的问题。微机器人作为微米级材料，能够在体内运动，磁控是其最常用的操控方法之一。利用微机器人的治疗性负载和非接触式操控特性，有望为 RCT 重建手术提供精确、实用且便捷的手术工具。

二、磁性 Janus 水凝胶微机器人的制备与表征

（一）负载纳米颗粒的表征

通过扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）对负载的纳米颗粒进行表征。结果显示，ZnO 纳米颗粒（Zn-NPs）呈圆柱形，尺寸为几百纳米；Fe₃O₄纳米颗粒（Fe-NPs）为球形，尺寸为几十纳米。能量色散光谱（Energy dispersive spectroscopy，EDS）表明，Zn-NPs 中 Zn 和 O 分布均匀，Fe-NPs 中 Fe 和 O 分布均匀。动态光散射（Dynamic light scattering，DLS）测量显示，Zn-NPs 的水合粒径范围为 200 - 700nm，Fe-NPs 的水合粒径范围为 40 - 90nm。X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析表明，Zn-NPs 的衍射图谱符合 ZnO 纳米颗粒的标准图谱，Fe-NPs 的衍射峰位置和强度与 Fe₃O₄纳米颗粒的标准图谱一致，且峰尖锐，表明其结晶度高。通过振动样品磁强计（Vibrating sample magnetometer，VSM）在室温下测量 Fe-NPs 的磁性，其矫顽力（Hc）为 141.51 Oe，饱和磁化强度（Ms）为 75.57 emu/g，剩余磁化强度（Mr）为 15.37 emu/g，表明 Fe-NPs 具有足够的磁化能力，适合加载到微机器人中用于磁操控。

（二）Janus 水凝胶微机器人的制备

利用气剪微流控平台制备磁性 Janus 水凝胶微机器人。该平台主要由电子注射泵、氮气瓶、定制双通道同轴针头系统和收集浴四部分组成。具体制备过程为：将含有 Mg₃(PO₄)₂（MgP）和 Fe-NPs 或 Zn-NPs 的 1%（w/v）海藻酸钠溶液分别通过两个注射器，在电子注射泵的控制下，以 1ml/h 的流速泵入不同的液体输送通道。氮气通过外针输送，为微滴的形成提供剪切力，其流速设置为 3 - 7L/min 以控制微机器人的大小。收集浴中含有 2%（w/v）的 CaCl₂溶液，用于交联海藻酸钠微滴，使其固化形成微机器人。

制备的微机器人具有高单分散性，在共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）、光学显微镜和荧光显微镜下呈现规则的 Janus 结构。通过调整氮气流量可轻松控制微机器人的大小，如氮气流量为 7L/min 时，微机器人尺寸为 381.3±21.5μm；5L/min 时，尺寸为 450.4±13.7μm；3L/min 时，尺寸为 725.0±36.0μm。不同尺寸的微机器人均保持良好的可注射性，考虑到不同物种 TBI 大小存在差异，最终选择直径为 450μm 的微机器人进行后续实验。冷冻扫描电子显微镜（Cryo-scanning electron microscopy，cryo-SEM）图像进一步揭示了微机器人两个分离隔室的形态差异，存在明显的分界线。SEM 和 EDS 分析证实，Mg 和 Fe 主要分布在微机器人的骨侧，而 Zn 主要分布在另一侧，表明微机器人中存在 Mg²⁺/Zn²⁺梯度。此外，该制备策略采用无油制备方法和离子交联策略，且使用 FDA 批准的海藻酸钠作为构建材料，保证了微机器人的生物相容性，为其临床转化提供了可能。

三、微机器人的性能与作用机制研究

（一）运动行为与矿物梯度重建效果

在 RCT 重建手术中，验证微机器人操控的可行性和准确性至关重要。研究发现，将 NdFeB 磁铁放置在距离微机器人约 2 - 3cm 处，产生约 100 - 150mT 的磁场，可有效控制微机器人的运动。在培养皿中，微机器人能在磁场作用下进行旋转运动并定向排列；在体外 TBI 模型中，微机器人的骨侧（含 Fe-NPs）会旋转并朝向骨，肌腱侧则朝向肌腱；在体内 RCT 模型中，微机器人经磁操控后也能实现良好的定向排列。通过建立模型方程，分析了微机器人尺寸（d）与操控其运动的最大磁距（Z）之间的关系，结果表明，将磁铁放置在距离直径超过 200μm 的微机器人 3cm 处，足以引发其旋转运动。

进一步研究微机器人对 TBI 矿物梯度重建的影响。通过评估正常大鼠肩袖中骨和肌腱组织的 Mg²⁺和 Zn²⁺浓度，发现 Mg²⁺在骨中的浓度是肌腱中的 8.7 倍，Zn²⁺在肌腱中的浓度是骨中的 1.8 倍，证实了 TBI 中存在矿物浓度梯度。实验选取了在体外实验中对 BMSCs 和 TCs 具有良好生物相容性且能促进细胞增殖的微机器人，其骨侧 Mg²⁺和肌腱侧 Zn²⁺的浓度接近天然骨和肌腱组织中的浓度。将微机器人浸入无菌磷酸盐缓冲盐水（Phosphate buffered saline，PBS）中模拟其在生理条件下的降解过程，从降解第 1 天到第 21 天，SEM 图像显示微机器人逐渐分解，但骨侧和肌腱侧的形态始终清晰；EDS 映射表明，降解后的微机器人中 Mg²⁺/Zn²⁺含量仍呈梯度分布。离子释放实验显示，微机器人中 Mg²⁺、Zn²⁺和 Fe²⁺/Fe³⁺均呈现持续释放曲线，释放时间超过 21 天，且微机器人的降解曲线缓慢，保留时间超过 21 天。这些特性确保了微机器人在体内的治疗效果，为 RCT 重建手术中恢复 TBI 的矿物梯度提供了有力支持。

（二）体外评估 Zn²⁺负载微机器人促进肌腱再生的能力

为研究 Zn²⁺负载微机器人促进肌腱再生的能力，构建了单室海藻酸钙（Ms）和 Zn-NPs 负载的单室微球（Zn-Ms）。通过 Live/Dead 染色和 Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测发现，Zn-Ms 与 TCs 共培养 3 天和 7 天后，几乎无细胞死亡，且 Zn-Ms 组的活细胞数量明显多于对照组和 Ms 组，表明 Zn-Ms 具有良好的生物相容性并能显著促进 TCs 增殖。Transwell 趋化实验和划痕愈合实验结果显示，Zn-Ms 组的 TCs 迁移能力明显增强，这得益于 Zn²⁺的趋化作用，使 TCs 能够更快地迁移到损伤区域，对肌腱再生至关重要。

在肌腱修复过程中，COL-I/COL-III 比值是评估肌腱愈合质量的重要指标，较高的比值意味着更好的愈合效果。细胞免疫荧光染色和实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）结果表明，Zn-Ms 能显著增加 COL-I 的表达，抑制 COL-III 的表达，同时上调肌腱再生和重塑的重要调节因子 Tenascin-C（TNC）以及肌腱特异性转录因子 Mohawk（MKX）的表达。这些结果表明，Zn-Ms 通过促进 TCs 的增殖、迁移和肌腱生成相关功能，确保了 TBI 愈合过程中高质量的肌腱重建。

（三）体外评估 Mg²⁺负载微机器人促进骨形成的能力

Mg²⁺负载的生物材料被认为具有良好的生物相容性，持续供应 Mg²⁺促进骨再生的体内外生物学效果前景广阔。对 Mg²⁺负载的微球（Mg-Ms）进行研究，Live/Dead 染色和 CCK-8 检测结果显示，Mg-Ms 对 BMSCs 无细胞毒性，且能在 1 - 7 天内加速 BMSCs 的增殖。Transwell 实验和划痕愈合实验表明，Mg-Ms 显著增强了 BMSCs 的迁移能力，使其能够更好地迁移到骨缺损区域。

通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色和茜素红染色（Alizarin red staining，ARS）评估 Mg-Ms 对 BMSCs 成骨分化的影响。结果显示，与其他组相比，Mg-Ms 组的 BMSCs 在 ALP 染色和 ARS 染色中呈现出更大的染色面积和更深的染色深度，表明 Mg²⁺能诱导 BMSCs 的 ALP 活性增加，促进 Ca²⁺沉积。细胞免疫荧光染色和 RT-qPCR 结果表明，Mg-Ms 能显著上调 BMP-2、RUNX-2、OCN 和 ALP 等成骨标记物的蛋白和 mRNA 表达。此外，研究还发现，Fe-NPs 负载的微球（Fe-Ms）与 BMSCs 和 TCs 共培养 7 天，无明显细胞毒性，且 Fe²⁺/Fe³⁺对 Ca²⁺促进 BMSCs 成骨分化和 TCs 肌腱生成相关功能的影响不显著。综上所述，Mg-Ms 通过促进 BMSCs 的增殖、迁移和成骨分化，证实了微机器人骨侧在 TBI 愈合过程中促进新骨形成的有效性。

（四）微机器人促进大鼠 RCT 愈合中梯度结构的再生

将 Janus 微机器人应用于大鼠 RCT 模型，评估其体内治疗效果。实验将大鼠分为 5 组：对照组（缝合）、Mg-Ms 组（缝合 + 负载 MgP 和 Fe-NPs 的微球）、Zn-Ms 组（缝合 + 负载 Zn-NPs 的微球）、Mg/Zn-Mixed-Ms 组（缝合 + 负载混合 MgP、Fe-NPs 和 Zn-NPs 的微球）和 Mg/Zn-Janus-Mr 组（缝合 + 分别负载 MgP & Fe-NPs 或 Zn-NPs 的 Janus 微机器人）。

通过微计算机断层扫描（Micro-computed tomography，micro-CT）评估大鼠肱骨头大结节处的新骨形成情况。结果显示，术后 4 周，Mg/Zn-Janus-Mr 组的肱骨头骨线相对连续，无明显缺损；术后 8 周，该组肱骨头大结节相对完整，接近正常解剖结构，表明微机器人促进了修复区域的骨形成。利用 7T 动物磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）系统评估肌腱再生情况，术后 4 周，Mg/Zn-Janus-Mr 组的肌腱信号强度明显低于其他组，表明炎症和水肿较轻；术后 8 周，该组肌腱信号相对连续，强度最低，接近正常肌腱，说明微机器人促进了肌腱再生。

对修复的 TBI 组织进行生物力学测试，结果显示，随着时间的推移，所有组的 TBI 组织力学性能（包括最大载荷和刚度）均有所增加，而 Mg/Zn-Janus-Mr 组的 TBI 组织强度最高，且在术后 4 - 8 周显著增加。这得益于微机器人再生的 TBI 梯度结构，能够有效分散应力载荷。通过步态分析评估大鼠前肢功能恢复情况，结果显示，Mg/Zn-Janus-Mr 组的大鼠在术后 4 周和 8 周的步幅长度和步长明显恢复，表明微机器人不仅促进了 TBI 的愈合，还改善了肢体功能。

通过组织学染色（HE、Masson 和 Sirius Red 染色）和改良组织学评分系统评估 TBI 的再生情况。结果显示，术后 4 周，Mg/Zn-Janus-Mr 组的骨形成成熟，与再生肌腱结构整合良好，胶原纤维密集且排列有序，组织学评分显著高于其他组；术后 8 周，所有组的修复情况均有所改善，但 Mg/Zn-Janus-Mr 组的骨修复和肌腱再生协同作用明显，呈现出明显的肌腱 - 骨过渡梯度结构，与天然 TBI 结构相似，组织学评分仍为最高。

通过多重免疫荧光分析微机器人诱导成骨的潜在机制。结果显示，Mg/Zn-Janus-Mr 组中关键成骨因子 BMP-2 的信号强度最高，分布最广，术后 4 周和 8 周表达 BMP-2 的细胞比例也最高；另一种重要的成骨标记物 OCN 在 Mg/Zn-Janus-Mr 组中的阳性染色明显高于其他组，定量分析表明该组表达 OCN 的细胞比例更高。在肌腱再生过程中，Mg/Zn-Janus-Mr 组促进了 COL-I 的表达和沉积，抑制了 COL-III 的表达，且 TNC 的阳性染色更高，表明微机器人成功重建了基质成分，刺激了 TCs 的功能。综合以上结果，微机器人通过促进成骨和肌腱生成，成功重建了 TBI 的梯度结构，促进了 TBI 的愈合。

（五）微机器人在 TBI 愈合过程中的免疫调节作用

适当的炎症反应有助于早期 TBI 愈合，但过度和持续的炎症会严重损害 TBI 愈合，导致病理性瘢痕组织形成，影响 TBI 的机械强度和生物学功能，增加再撕裂和失败的风险。在 TBI 愈合的炎症反应中，巨噬细胞的积累和表型改变起着关键作用。免疫调节生物材料可通过清除活性氧（Reactive oxygen species，ROS），减少 M1 巨噬细胞积累，诱导 M2 巨噬细胞极化，优化组织修复结果<研究通过将微球与脂多糖（lps）刺激的 raw 264.7 细胞共培养，评估微机器人的免疫调节作用。结果显示，微机器人能有效清除巨噬细胞内的 ros，其抗 ros 作用归因于释放的>²⁺和 Zn²⁺的协同效应。免疫荧光染色和 RT-qPCR 实验表明，微机器人抑制了 M1 巨噬细胞特异性标记物（iNOS 和 CD86）的表达，促进了 M2 巨噬细胞表面标记物（CD206）的表达，且 Mg/Zn-Janus-Mr 组的效果优于 Mg-Ms 组和 Zn-Ms 组，证实微机器人通过 Mg²⁺和 Zn²⁺的协同 ROS 清除作用，抑制 M1 极化，促进 M2 极化。在体内实验中，对大鼠 RCT 重建手术后 4 周的再生 TBI 进行免疫荧光染色，发现对照组中 CD86 阳性细胞丰富，表明手术引发了炎症反应；而 Mg-Ms 组或 Zn-Ms 组干预后，CD86 阳性细胞数量显著减少，CD206 阳性细胞数量增加；Mg/Zn-Janus-Mr 组的 CD86 阳性细胞比例最低，CD206 阳性细胞成为主要的巨噬细胞表型，表明微机器人的免疫调节作用触发了 TBI 愈合过程中免疫微环境从促炎到促修复的转变。综上，具有免疫调节作用的微机器人在体外和体内均能清除 ROS，减少 M1 巨噬细胞积累，诱导 M2 巨噬细胞极化，为 TBI 重建提供了促愈合的免疫环境。