一种 WYL 结构域转录因子通过感知 c-di-GMP 调控植物乳杆菌肠道定植

为探究 c-di-GMP 对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）定植的调控作用，研究发现 MbpR 可感知 c-di-GMP 调节定植，意义重大。

　　在人体肠道这个神秘的 “生态系统” 中，益生菌就像一群守护健康的小卫士，其中植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）凭借改善宿主健康的多种益生功能备受关注。它能像勤劳的园丁一样，通过产生吲哚 - 3 - 乳酸改善结直肠癌发生，还能像贴心的护理员，在大型双盲试验中帮助管理年轻人的慢性腹泻，甚至在调节肠道微生物群、缓解溃疡性结肠炎方面也表现出色。

然而，植物乳杆菌要在肠道这个复杂多变的环境中 “安居乐业” 并非易事。肠道内胃酸（pH 1.5 - 4.5）像强酸 “卫士”、胆汁盐（0.3% - 0.5% w/v）似高盐 “屏障”，还有各种消化酶 “捣乱”，重重关卡让益生菌的定植困难重重。不仅如此，肠道内早已 “居住” 着大量的本土细菌，它们与外来的益生菌激烈竞争空间和营养。在这样的情况下，植物乳杆菌如何成功定植并发挥作用，一直是科学家们想要解开的谜题。

海南大学食品科学与工程学院、海南大学 “同一健康” 协同创新中心等机构的研究人员决心攻克这一难题。他们深入研究，发现了一个关键的 “信号指挥官”—— 环二鸟苷酸（c-di-GMP），它作为细菌的第二信使，在调控细菌多种生物功能方面起着至关重要的作用，但此前 c-di-GMP 对植物乳杆菌定植的调控作用却鲜为人知。经过一系列研究，他们揭示了一种含 WYL 结构域的转录因子 MbpR，它就像 c-di-GMP 的 “专属接收器”，能感知 c-di-GMP 信号，进而调控植物乳杆菌的肠道定植行为。这一发现为深入理解益生菌与宿主的相互作用机制提供了重要线索，也为开发更有效的益生菌制剂奠定了理论基础，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员开展此项研究运用了多种关键技术方法。通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术检测植物乳杆菌 WCFS1 中的 c-di-GMP；利用基因编辑技术构建单基因缺失突变体，探究 c-di-GMP 代谢酶对其浓度的影响；采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）技术确定 MbpR 的 DNA 结合位点；借助 RNA 测序（RNA-Seq）分析基因表达变化。

下面来看具体的研究结果：

• c-di-GMP 调节植物乳杆菌的肠道定植行为：研究人员通过 LC-MS 在植物乳杆菌 WCFS1 中检测到 c-di-GMP，其浓度为 32 ± 4 pmol/mg 蛋白。通过过表达活性 c-di-GMP 合成酶 WspR 或降解蛋白 RocR，发现 c-di-GMP 能提高植物乳杆菌在酸性和胆汁盐环境中的生存能力，增强其对 HT-29 细胞的黏附能力和在小鼠结肠中的定植能力。这表明 c-di-GMP 通过改善植物乳杆菌的生存和黏附能力，促进了其肠道定植。
• 植物乳杆菌 WCFS1 中的双鸟苷酸环化酶和 c-di-GMP 特异性磷酸二酯酶：研究人员利用 BLAST 算法和 InterPro 分析，在植物乳杆菌 WCFS1 基因组中找到了编码 GGDEF 结构域的双鸟苷酸环化酶（DGCs）基因 dgcA、dgcB、dgcC、dgcD，以及编码 EAL 结构域的磷酸二酯酶（PDEs）基因 pdeA、pdeB、pdeC、pdeD、pdeE ，但未发现 HD-GYP 结构域编码基因。体外实验表明，DgcB、DgcC、DgcD 具有 DGC 活性，可将 GTP 转化为 c-di-GMP，而 PdeA 和 PdeD 具有 PDE 活性，能将 c-di-GMP 降解为 pGpG 。构建单基因缺失突变体后发现，ΔdgcB、ΔdgcC、ΔdgcD 突变体的细胞内 c-di-GMP 水平下降，而 pdeA 和 pdeD 缺失突变体的 c-di-GMP 水平上升。这些结果表明，DgcB、DgcC、DgcD 是活性 DGCs，PdeA 和 PdeD 是活性 PDEs。
• MbpR 是 c-di-GMP 的效应蛋白：研究人员通过亲和拉下实验和质谱分析，发现 MbpR 是潜在的 c-di-GMP 受体。进一步研究表明，MbpR 以单体形式存在，其 WYL 结构域能与 c-di-GMP 特异性结合，结合常数（KD?）为 0.22 μM。定点突变实验发现，R192 和 E268 这两个氨基酸残基对 MbpR 与 c-di-GMP 的结合至关重要。敲除 mbpR 基因后，植物乳杆菌对 HT-29 细胞的黏附能力和在结肠中的定植能力显著增强，而过表达野生型 MbpR 可恢复突变体表型，几乎丧失 c-di-GMP 结合活性的MbpRR192A对表型的互补作用更强。这说明 MbpR 是 c-di-GMP 的效应蛋白，可负向调控植物乳杆菌的黏附和定植能力。
• MbpR 与特定 DNA 序列结合：研究人员利用 ChIP-Seq 技术在全基因组范围内鉴定 MbpR 的结合位点，发现其广泛分布于植物乳杆菌 WCFS1 染色体上。通过 MEME 分析确定了 MbpR 的潜在结合基序为 5’-YAATGGTGCCA-3’，并通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证了 MbpR 与该序列的特异性结合。此外，研究还发现 MbpR 主要结合在编码 DNA 序列（CDS）区域，而非启动子区域，且结合后会抑制相关基因的转录。
• MbpR 结合降低黏蛋白结合蛋白（MucBPs）的转录水平：研究人员发现 MbpR 可介导植物乳杆菌 WCFS1 对 HT-29 细胞的黏附和肠道定植行为，进一步研究发现 mbpA 和 mbpB 编码的 MucBPs 参与了这一过程。MbpR 通过结合 mbpA 和 mbpB 的 CDS 区域，降低其转录水平，进而影响植物乳杆菌的黏附能力。当 c-di-GMP 与 MbpR 结合后，MbpR 从 mbpA 和 mbpB 的 CDS 区域解离，促进了 MucBPs 的表达，增强了植物乳杆菌的定植能力。
• c-di-GMP 通过抑制 MbpR 结合介导植物乳杆菌的肠道定植：研究人员通过 EMSA 实验发现，c-di-GMP 可抑制 MbpR 与 mbpA 和 mbpB CDS DNA 片段的结合，且突变 c-di-GMP 结合位点（R192A）可消除这一作用。通过构建 DGC-null 突变体（Δ3DGC）和 PDEs 缺失突变体（Δ2PDE），发现 Δ3DGC 突变体中 c-di-GMP 浓度降低，mbpA 和 mbpB 的转录水平下调；而 Δ2PDE 突变体中 c-di-GMP 浓度升高，mbpA 和 mbpB 的转录水平显著上调。这表明 c-di-GMP 通过抑制 MbpR 与 MucBPs CDS 的结合，促进了 MucBPs 的表达，进而介导植物乳杆菌的肠道定植。

综合研究结果和讨论部分，此项研究意义非凡。研究人员首次发现了 MbpR 作为 c-di-GMP 受体在植物乳杆菌肠道定植中的关键调控作用，揭示了一条 c-di-GMP 调控植物乳杆菌肠道定植的新途径。虽然目前该调控模型中仍存在一些细节有待进一步研究，比如 GGDEF/EAL 结构域蛋白感知的具体信号等，但这一发现为深入理解益生菌与宿主的相互作用机制提供了新的视角，也为优化益生菌制剂、提高其在肠道中的定植效率提供了理论依据，有望推动益生菌在健康医学领域的更广泛应用。