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为探究血清 - free 培养时间对脂肪基质细胞（AdSCs）来源小细胞外囊泡（sEVs）的影响，研究人员进行相关实验，发现不同时段 sEVs 差异显著，对施万细胞增殖效果不同，为 sEVs 应用提供依据。
在生命科学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）就像细胞间的 “信使”，携带各种重要信息，在细胞间的通讯中发挥着关键作用。特别是小细胞外囊泡（Small Extracellular Vesicles，sEVs），由于其高度的生物活性，在再生医学领域备受关注，被视为一种极具潜力的无细胞治疗方法。间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells，MSC）来源的 sEVs 能促进多种细胞增殖，而脂肪组织中的多能基质细胞，即脂肪基质细胞（Adipose tissue-derived stromal cells，AdSCs），可通过抽脂大量获取，其来源的 sEVs 有望用于自体治疗，促进组织再生。
然而，目前该领域面临着诸多挑战。细胞培养基常含血清，血清中的 EVs 和共分离蛋白会干扰实验，因此研究 sEVs 时需采用血清 - free 培养基。但血清是常用培养基成分，虽然有研究开发血清替代物，如 EV-depleted 血清和商业无 EV 产品，但仍存在问题，部分血清替代物中仍有 EVs 残留，会影响实验结果。而且，血清 - free 培养时间在文献中差异很大，从过夜到 72 小时不等，这种差异导致实验结果缺乏可重复性和可比性。为了解决这些问题，来自奥地利医科大学等机构的研究人员开展了相关研究，研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞和组织处理技术：从青春期雄性 Sprague Dawley 大鼠获取坐骨神经和腹部脂肪组织，分离培养 AdSCs 和施万细胞（Schwann cells，SC），并对其进行鉴定 。
- sEVs 分离和富集技术：对达到一定融合度的 AdSCs 进行血清 - free 培养，每隔 24 小时收集并更换条件培养基，通过差速离心和过滤等步骤，富集不同时段（0 - 24 小时、24 - 48 小时、48 - 72 小时）释放的 sEVs。
- sEVs 分析技术：运用冷冻电镜（Cryo-EM）、原子力显微镜（AFM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质测量、免疫表型分析等多种技术，对 sEVs 的大小、形态、表型表达等进行分析。
- 细胞增殖实验技术：将不同时段的 sEVs 与 SC 共培养，通过测量细胞融合度和增殖率，评估 sEVs 对 SC 增殖的影响。
研究结果如下：
- AdSCs 的特性：培养的原代 AdSCs 具有典型的形态、免疫表型和多向分化潜能，证明成功培养 AdSCs。
- 血清 - free 培养对 AdSCs 活力的影响：通过 MTT 实验发现，血清 - free 培养条件下，AdSCs 的活力和代谢活性随时间下降，48 小时后差异显著，72 小时时活力明显低于 24 小时培养的细胞。
- sEVs 的定量分析：采用微 BCA 试剂盒和 NTA 对 sEVs 进行定量分析，结果显示随着血清 - free 培养时间延长，检测到的 sEVs 颗粒数量和总蛋白量均减少；颗粒 / 细胞比在 48 小时内保持稳定，第 3 天显著下降；颗粒 / 蛋白比在中间和后期组更高，表明可能存在较大囊泡或杂质污染。
- sEVs 的大小和表型分析：NTA 分析表明，早期（0 - 24 小时）释放的 sEVs 粒径显著小于后期；早期 sEVs 中包含更多外切体（0 - 45nm）和小 sEVs（45 - 105nm），后期大 sEVs（105 - 165nm）和更大颗粒增多。免疫表型分析发现，不同时段 sEVs 的表面蛋白表达存在差异，如 CMG 在早期和中间组表达较高，不同组 sEVs 中 CD9、CD63、CD81 等四跨膜蛋白表达有差异趋势，且后期 sEVs 供体间差异更大。
- sEVs 的形态分析：Cryo-EM 和 AFM 结果证实了 NTA 的发现，显示 sEVs 大小和膜结构高度异质，AFM 还发现 sEVs 直径与血清 - free 培养时间呈正相关。
- 主成分分析（PCA）结果：PCA 分析表明，早期 sEVs 与小 sEVs 和外切体以及某些蛋白高表达相关，可与中间和后期 sEVs 明显区分，中间和后期 sEVs 分散度更高，供体间差异更大。
- sEVs 对 SC 增殖的影响：将 sEVs 与 SC 共培养，发现只有早期 sEVs 能显著促进 SC 的融合度和增殖率，中间和后期 sEVs 效果不明显。
研究结论和讨论部分指出，本研究对 AdSCs 来源的 sEVs 进行了多方面分析，为血清 - free 条件下的最佳培养时间提供了参考。虽然所有组的颗粒都符合 sEVs 的特征，但早期（24 小时内）释放的 sEVs 对促进 SC 增殖效果最佳，这对于周围神经再生具有重要意义。不过，本研究仅评估了 sEVs 对 SC 增殖的影响，未来还需研究其对其他细胞类型的作用，以及分析 EVs 的 cargo 成分。同时，研究强调了培养时间对 sEVs 特性影响很大，需要标准化，以更好地比较 sEVs 对细胞相互作用的影响，为 sEVs 在再生医学中的临床应用奠定了更坚实的基础。
