创新分光光度法：同时测定西洛多辛与米拉贝隆，助力药物分析与绿色化学发展

研究人员为同时测定西洛多辛（SLD）和米拉贝隆（MRB），开发四种分光光度法，结果良好且更环保。

　　

研究背景

在男性健康领域，膀胱过度活动症（Overactive Bladder，OAB）和良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH）是常见的困扰。尤其是 45 岁以上的男性，OAB 带来的频繁症状，如尿急、夜尿增多以及排尿不尽感等，严重影响着他们的生活质量，极端情况下甚至可能引发下尿路感染和肾衰竭。目前，联合使用抗毒蕈碱药物和 α-1 阻滞剂被认为是治疗 BPH 相关 OAB 的有效方案，西洛多辛（Silodosin，SLD）和米拉贝隆（Mirabegron，MRB）的组合药物也因此在印度市场获批。

然而，在药物分析方面却面临着挑战。虽然已有多种分析方法用于检测 SLD 和 MRB，但同时测定二者的方法却极为有限，目前仅有高效液相色谱法（HPLC）这一种报道。HPLC 虽灵敏度高，但存在耗时久、仪器昂贵、需大量高纯度有机溶剂以及依赖专业技术人员操作等问题，这使得它在常规分析和质量控制中存在一定局限性。为了解决这些问题，来自埃及多家大学（米尼亚大学、索哈杰大学等）的研究人员展开了深入研究，其研究成果发表在《BMC Chemistry》杂志上。

研究方法

研究人员开发了四种基于简单数学计算的紫外分光光度法，分别为双波长法（DW）、诱导双波长法（IDW）、比率差法（RD）和曲线下面积法（AUC）。在实验过程中，利用 PG Instruments 的 T80 双光束 UV-VIS 分光光度计结合 UVWin 5 软件进行分光光度测量，使用石英比色皿和双重蒸馏水，并借助梅特勒 - 托利多 5 位天平进行精确称量。通过制备标准溶液、设定不同的浓度范围，对合成混合物和实验室自制片剂进行测定。同时，采用国际人用药品注册技术协调会（ICH）的指导原则对方法进行验证，并运用分析绿色度计算器（AGREE）和绿色分析程序指数（GAPI）工具评估方法的环境友好性。

研究结果

1. 溶剂选择：研究人员评估了多种溶剂作为稀释剂的潜力，发现甲醇在众多溶剂（包括甲醇、水、乙醇、乙腈、0.1M NaOH 和 0.1M HCl）中表现出最高的吸光度，因此选择甲醇作为最适宜的稀释剂。
2. 方法优化
   • DW 方法：该方法通过精心选择波长，成功消除了 SLD 和 MRB 混合物中的干扰。测定 SLD 时选用 217.5 和 271nm 波长，测定 MRB 时则选用 251 和 281nm 波长。在相应的浓度范围内（SLD 为 1 - 15μg mL^-1，MRB 为 2 - 25μg mL^-1）绘制吸光度差异与浓度的校准曲线，并计算出回归方程。
   • IDW 方法：此方法通过数学波长操作提升了选择性。测定 SLD 时选取 220nm 和 230nm 波长，通过乘以纯 MRB 的平等因子（F = A220/A230 = 0.557）调整 230nm 处的吸光度；测定 MRB 时选择 250nm 和 258nm 波长，乘以纯 SLD 的平等因子（F = A250/A258 = 0.749）调整 258nm 处的吸光度。在特定浓度范围内（SLD 为 2 - 15μg mL^-1，MRB 为 1 - 25μg mL^-1）绘制差异值与浓度的校准曲线。
   • RD 方法：该方法通过简单的数学计算消除干扰。测定 SLD 时，将其光谱除以浓度为 6μg mL^-1的 MRB 光谱；测定 MRB 时，将其零级吸收光谱除以浓度为 4μg mL^-1的 SLD 光谱。分别在特定波长（SLD 为 222 和 245nm，MRB 为 250 和 285nm）测量比率光谱的振幅并计算差异，在相应浓度范围（SLD 为 2 - 20μg mL^-1，MRB 为 2 - 25μg mL^-1）绘制校准曲线。
   • AUC 方法：该方法通过选择合适的波长范围计算曲线下面积来消除干扰。最终选定 217 - 223nm 和 245 - 253nm 这两个波长范围，在相应浓度范围（SLD 为 2 - 15μg mL^-1，MRB 为 2 - 25μg mL^-1）绘制 AUC 值与浓度的校准曲线，并计算出浓度。
3. 方法验证
   • 线性和范围：在设定的实验条件下，对 SLD 和 MRB 的七个浓度进行线性评估，结果显示在 1 - 20μg mL^-1（SLD）和 1 - 25μg mL^-1（MRB）的浓度范围内，二者浓度与测量值呈现良好的线性关系。
   • 检测限（LOD）和定量限（LOQ）：按照 ICH 建议计算得出，各方法的 LOD 和 LOQ 值表明了方法的灵敏度。
   • 准确性和精密度：通过标准加入法计算平均回收率评估准确性，结果显示各浓度下的回收率良好。测定不同浓度药物的日内和日间精密度，相对标准偏差均持续保持在 2% 以下，证明了方法的高准确性和精密度。
   • 选择性：分析五种合成混合物，结果表明不同比例的 SLD 和 MRB 之间无干扰，确认了方法的选择性。
4. 药物应用：在实验室制备的片剂配方分析中，四种方法均获得了良好的回收率，证实无基质影响。与已报道的 HPLC 方法进行 F 检验和学生 t 检验，结果显示在 95% 置信水平下，计算值均低于表格值，表明新方法与 HPLC 方法在准确性和精密度上无明显差异，能够准确测定联合片剂中的 SLD 和 MRB。
5. 方法绿色度评估：使用 GAPI 和 AGREE 工具评估方法的绿色度，结果表明新开发的分光光度法比 HPLC 方法更环保。GAPI 评估显示，分光光度法有 9 个绿色、4 个黄色和 2 个红色阴影区域，而 HPLC 方法有 7 个绿色、4 个黄色和 4 个红色阴影区域；AGREE 评估中，分光光度法的得分为 0.75，高于 HPLC 方法的 0.66，且二者中心均为绿色，表明分光光度法绿色程度更高。

研究结论与意义

研究人员成功开发的四种分光光度法简单、经济、灵敏且环保，无需预先分离即可同时分析 SLD 和 MRB。这些方法线性范围良好，在合成混合物和市售片剂中展现出出色的回收率，不受药物辅料的影响。与传统的 HPLC 方法相比，新方法在环境可持续性方面更具优势，适合在缺乏色谱仪器的质量控制实验室中进行常规分析。不过，这些分光光度法也存在局限性，即无法对生物流体中的 SLD 和 MRB 进行定量。未来的研究方向是开发更灵敏的分析方法，以实现对人体血浆和尿液中这两种药物的测定。这一研究成果为药物分析领域提供了新的选择，有望推动相关药物质量控制和分析技术的发展。