突破！大规模制备工程化 ARRDC1 介导微泡的新进展

为解决 ARMMs 临床应用的生产难题，研究人员评估两种策略，实现大规模生产，推进其体内治疗应用。

　　

细胞 “快递员” 的升级之路：工程化 ARRDC1 介导微泡的创新研究

在生命的微观世界里，细胞之间时刻进行着繁忙的 “信息交流”，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）就是其中重要的 “快递员”。这些天然存在的小囊泡，不仅能避免引发免疫反应和毒性，还能精准地将各种生物分子运送到靶细胞，因此在药物递送领域极具潜力。ARRDC1 介导的微泡（ARMMs）作为 EVs 家族的一员，直径在 40 - 100nm 之间，由多种细胞表面产生。它不仅在非经典 NOTCH 信号通路中发挥作用，还能在重金属暴露时招募和转移抗氧化蛋白。然而，ARMMs 就像一个神秘的包裹，其在信号传导和特定货物转运中的广泛作用仍然未知。

尽管此前有研究在实验室规模展示了工程化 ARMMs 携带货物的可行性，但距离临床应用还面临诸多挑战。其中最大的难题之一就是如何实现 ARMMs 的大规模生产。目前，尚无证据表明其生产可以扩大到支持临床试验的规模。此外，生产过程中的细胞选择、基因导入方式以及大规模纯化方法等都是亟待解决的问题。

为了攻克这些难题，来自 Vesigen Therapeutics、Lonza Cell & Gene Technologies 等机构的研究人员 Kristin Luther、Ali Navaei 等人开展了一项深入研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员为实现 ARMMs 的大规模生产和纯化，主要采用了以下几种关键技术方法：

1. 细胞培养技术：选用悬浮适应的 HEK293 衍生细胞系 5B8 进行培养，摸索出其适宜的培养条件，包括培养基成分、温度、CO₂浓度等，为后续实验奠定基础。
2. 转染与稳定细胞系构建技术：通过瞬时转染不同质量比的转染试剂（PEI MAX?）与质粒 DNA，评估其对细胞活力、ARMM 加载和生产的影响；同时，利用慢病毒转导构建稳定表达 ARRDC1 - GFP 的 5B8 细胞系，为大规模生产提供稳定来源。
3. 分离与纯化技术：研究采用两种策略，一是传统的超速离心（Ultracentrifugation，UC）用于小规模 ARMMs 的分离；二是创新地结合切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）和阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，AEX）用于大规模生产时的纯化，有效去除杂质，提高产品质量。
4. 表征与分析技术：运用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）、纳米流式细胞术（Nano - flow cytometry）等多种技术，对 ARMMs 的大小、浓度、蛋白含量、标记物表达等进行全面表征和分析；并通过 ELISA 实验评估其生物活性、生物分布和药代动力学。

接下来看看具体的研究结果：

1. 5B8 HEK293 细胞在悬浮培养中高效产生 ARMMs：研究人员对 5B8 细胞进行瞬时转染实验，评估了 4 种不同的转染条件。结果显示，使用 PEI 转染虽会降低细胞活力，但在收获条件培养基（CM）前，细胞活力仍能保持在 80% 以上。与对照相比，过表达 ARRDC1 显著增加了 ARMMs 的生成和加载，且转染细胞产生的 ARMMs 中较小颗粒比例更高。通过纳米流式细胞术分析发现，约 50% 的颗粒为 GFP 阳性，表明这些颗粒成功负载了目标蛋白。此外，这也是首次证明悬浮细胞系在无血清培养基中可产生 ARMMs。
2. 构建稳定的 5B8 HEK293 生产细胞系支持 ARMMs 的规模化生产：经慢病毒转导和嘌呤霉素筛选，成功构建稳定表达 ARRDC1 - GFP 的 5B8 细胞系。该细胞系在摇瓶培养中，0.5×10⁶/mL 的接种密度可保证细胞稳定生长和高活力。纳米流式细胞术检测显示，其 CM 中颗粒浓度与对照相似，但 55.6% 为 GFP 阳性。通过 Western blot 分析，确定了每颗粒中 ARRDC1 的含量约为 76±10 分子 / EV。
3. 利用搅拌罐生物反应器和可扩展的下游工艺生产 ARMMs：将稳定表达 ARRDC1 - GFP 的 HEK293 细胞接种到 3L 搅拌罐生物反应器中进行培养，细胞密度和活力在整个过程中保持良好，表明该工艺具有可重复性。下游工艺中，TFF 和 AEX 有效浓缩和纯化了 ARMMs，去除了大量宿主细胞蛋白。最终产品中，ARMMs 的加载效率较高，约有 112 个 ARRDC1 - GFP 分子 / EV，且 CD63、CD9 和 CD81 等标记物在整个过程中保持相对稳定。
4. 5B8 HEK293 来源的 ARMMs 的生物活性、生物分布和药代动力学：与超速离心纯化的 ARMMs 相比，TFF/AEX/TFF 工艺纯化的 ARMMs 在 A549 细胞中的摄取更高，表明该纯化步骤未损害其生物活性。在小鼠体内实验中，ARMMs 经静脉注射后迅速在脾脏和肝脏中积累，在肾脏和肺中也有一定程度的分布，血浆半衰期为 6±0.4 分钟。

研究人员成功评估了两种可扩展的策略来生成负载蛋白货物的 ARMMs，证明了 5B8 HEK293 细胞系在悬浮培养中可高效产生 ARMMs，且构建的稳定细胞系和可扩展的下游工艺为大规模生产 ARMMs 提供了可能。这一成果为未来将 ARMMs 作为非病毒载体用于体内治疗分子的递送奠定了坚实基础，有望推动基因治疗等领域的临床发展。不过，研究也存在一些局限性，例如未评估剂量对生物分布的影响等。未来，还需要进一步优化生产和纯化工艺，深入研究 ARMMs 的作用机制和应用效果，为其临床转化提供更充分的证据。