RsWRKY40 调控萝卜抗寒机制：蔗糖积累与 CBF 通路的协同作用

为探究萝卜应对冷胁迫的分子机制，研究人员对 RsWRKY40 展开研究，揭示其调控通路，助力萝卜抗寒育种。

　　萝卜，这种常见的根菜类蔬菜，在我们的餐桌上十分常见。它富含维生素、矿物质和碳水化合物，是人们饮食中的重要组成部分。然而，萝卜的生长并非一帆风顺，尤其是在寒冷的环境中，低温成为了限制其生长和产量的重要因素。从冬季到早春，较低的温度会抑制萝卜维管束形成层细胞的分裂，导致维管束形成层活性降低，主根生长受阻。不仅如此，低温还会影响萝卜的抗寒能力，使其在寒冷环境下更容易受到伤害。

目前，虽然科学家们在拟南芥等植物中对根生长发育和冷胁迫响应的分子机制有了一定的了解，但对于萝卜这类形成层驱动的根菜类作物，低温对其形成层活性和根生长的影响机制仍知之甚少。在蔗糖合成方面，尽管已知蔗糖与植物的根生长和抗冻性相关，蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因参与蔗糖合成和积累并响应非生物胁迫，但在萝卜等根菜类作物中，冷诱导的蔗糖合成转录网络尚不清楚。此外，植物中 WRKY 转录因子虽广泛参与抗寒调控，但在形成层驱动的根菜类作物中，它们如何协调冷诱导的蔗糖积累和 CBF（C-repeat binding factor）信号传导来响应冷胁迫，也有待研究。

为了深入探究萝卜形成层活性和抗寒能力的转录调控机制，南京农业大学国家作物遗传与种质创新利用重点实验室等研究机构的 Sen Chen、Liang Xu 等研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Molecular Horticulture》上，为萝卜及其他根菜类作物的抗寒遗传改良提供了重要的理论依据。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是全基因组关联研究（GWAS），通过对 179 份萝卜种质资源进行分析，检测与可溶性糖含量相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定候选基因。其次，利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术沉默目标基因，探究其功能。同时，采用酵母单杂交（Y1H）实验和双荧光素酶报告基因检测等方法，验证转录因子与基因启动子之间的相互作用。

研究结果如下：

1. RsSPS1 是与蔗糖含量相关的候选基因：通过 GWAS 分析，研究人员发现一个位于 2 号染色体上的显著 SNP 与基因 Rsa2g017240 密切相关，该基因编码蔗糖磷酸合成酶，被命名为 RsSPS1。转录组数据和 RT-qPCR 结果显示，RsSPS1 的表达在冷处理后显著上调，表明其可能在低温下的蔗糖合成中起关键作用。
2. 蔗糖对萝卜主根生长和抗寒至关重要：外施 60 mM 蔗糖溶液处理萝卜植株后，萝卜主根的长度、重量和宽度均增加，蔗糖含量和 SPS 活性也有所上升。同时，冷胁迫下，蔗糖处理的萝卜中脯氨酸和叶绿素含量更高，活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）含量更低，且形成层细胞中 PCNA（增殖细胞核抗原，参与 DNA 复制，其丰度在活跃分裂细胞中高度富集）信号增强。这表明蔗糖参与了萝卜主根生长、抗寒调节以及维管束形成层细胞分裂活性的维持。
3. RsSPS1 正向调控萝卜的冷胁迫响应：利用 VIGS 技术沉默 RsSPS1 后，萝卜植株的 SPS 活性和蔗糖含量显著降低，冷胁迫下叶片出现萎蔫和卷曲，叶绿素和脯氨酸含量下降，MDA 和 H₂O₂含量上升，PCNA 信号减弱。而过表达 RsSPS1 则会提高植株的抗寒能力，这些结果表明 RsSPS1 正向调控萝卜的冷胁迫响应和形成层细胞分裂活性。
4. RsWRKY40 是 RsSPS1 的上游转录因子：通过 Y1H 实验，研究人员发现 WRKY 转录因子 RsWRKY40 与 RsSPS1 启动子相互作用。双荧光素酶报告基因检测进一步证实，RsWRKY40 可直接激活 RsSPS1 的表达。亚细胞定位实验表明 RsWRKY40 位于细胞核内，且其启动子活性可被低温激活，说明 RsWRKY40 是一种冷诱导的核蛋白。
5. RsWRKY40 调节 RsSPS1 介导的蔗糖合成响应冷胁迫：过表达 RsWRKY40 的转基因拟南芥植株在冷胁迫后，叶片萎蔫程度较轻，MDA 积累较少，叶绿素和脯氨酸含量较高，SPS 活性和蔗糖含量也更高，表明 RsWRKY40 对萝卜的抗寒和蔗糖积累至关重要。沉默 RsWRKY40 则导致萝卜植株抗寒能力下降，RsSPS1 表达下调，蔗糖含量和 SPS 活性降低，形成层活性减弱。外施蔗糖可恢复沉默植株的抗寒表型，说明 RsWRKY40 通过调节蔗糖积累参与冷胁迫响应和形成层活性调节。
6. RsWRKY40 通过 CBF 依赖途径调节抗寒能力：生物信息学分析表明 RsCBF1 和 RsCBF2 启动子含有多个 WRKY 结合位点，Y1H 实验和双荧光素酶报告基因检测证实 RsWRKY40 可激活 RsCBF1 和 RsCBF2 的表达，说明 RsWRKY40 通过 CBF 依赖途径正向调节萝卜的冷胁迫响应。
7. RsWRKY40 增强自身转录：RsWRKY40 启动子序列中含有 5 个保守的 W-box 元件，Y1H 实验和双荧光素酶报告基因检测表明 RsWRKY40 可直接结合自身启动子并激活其表达，形成正反馈调节环，调控萝卜的冷胁迫响应。

研究结论和讨论部分指出，RsSPS1 在萝卜的冷胁迫响应和形成层活性维持中起着关键作用，其通过调节蔗糖合成，既有助于维持植物的渗透平衡、清除 ROS 以增强抗寒能力，又能促进主根生长和维持形成层活性。RsWRKY40 则通过 CBF 依赖和非依赖途径协调冷胁迫响应，一方面促进 RsSPS1 介导的蔗糖积累，另一方面激活 RsCBF1 和 RsCBF2 的表达，同时通过增强自身转录形成正反馈调节环，进一步增强萝卜的抗寒能力。

这项研究首次揭示了 RsWRKY40 通过整合蔗糖积累和 CBF 依赖途径调控萝卜冷胁迫响应的转录模块，为深入理解冷响应蔗糖积累和形成层活性的分子机制提供了新的视角。这不仅有助于萝卜抗寒品种的遗传改良，也为其他根菜类作物的抗寒研究提供了重要参考，有望推动相关领域的进一步发展，提高根菜类作物在低温环境下的产量和品质。