PPTC7：调控线粒体自噬的关键因子，开启疾病研究新方向

为探究 SCFFBXL4复合物调控机制，研究人员研究 PPTC7，发现其是该复合物辅助因子，可抑制 BNIP3/3L 依赖的线粒体自噬。

　　在细胞的微观世界里，线粒体就像一个个能量工厂，为细胞的正常运转提供源源不断的动力。而线粒体自噬（mitophagy）则像是工厂里的 “清洁小卫士”，专门负责清除那些受损、功能异常或者多余的线粒体，维持细胞内环境的稳定。一旦这个 “清洁” 过程出现问题，就如同工厂的垃圾处理系统故障，各种 “垃圾”—— 受损线粒体不断堆积，会引发一系列严重的后果，与神经退行性疾病、代谢紊乱、癌症以及心血管疾病等多种病症的发生发展紧密相关。

目前，大多数关于线粒体自噬的研究都集中在帕金森病相关蛋白 PINK1 和 Parkin 所参与的经典途径上，但越来越多的研究发现，基础线粒体自噬活动在很大程度上并不依赖这条途径。另外，像 BNIP3、BNIP3L 等线粒体外膜受体在其中的作用逐渐受到关注，它们就像是连接待清除线粒体和细胞自噬机制的 “桥梁”，对线粒体自噬的发生至关重要。同时，FBXL4 作为 E3 泛素连接酶复合物 SCF^FBXL4的关键组成部分，其功能异常会导致线粒体 DNA 耗竭综合征 13 型（MTDPS13），但 SCF^FBXL4复合物自身的调控机制却鲜为人知。

为了深入探究这些谜题，复旦大学的研究人员展开了一项意义重大的研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》上，为我们理解线粒体自噬的调控机制打开了新的大门。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，进行了细胞培养，包括 293T、HeLa、MEF、Caki-1 和 CCF-RC1 等多种细胞系的培养；利用免疫共沉淀（co-IP）技术验证蛋白质之间的相互作用；通过基因编辑技术 CRISPR/Cas9 构建 PPTC7、FBXL4 或 ATG7 基因敲除（KO）细胞系。在动物实验方面，构建了 Pptc7 基因敲除小鼠模型，获取小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行相关研究。此外，还运用了蛋白质印迹（WB）分析、实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-qPCR）、免疫荧光（IF）和共聚焦显微镜观察等技术手段，从不同层面深入研究相关蛋白和基因的表达变化。

下面来看看具体的研究结果：

1. PPTC7 与 BNIP3/3L 和 FBXL4 相互作用：研究人员通过分析基因共依赖数据集，发现 FBXL4 与 PPTC7 存在强正相关且共处于一个共必需模块。随后，利用免疫共沉淀实验证实了 PPTC7 能与 BNIP3、BNIP3L 以及 FBXL4 相互作用。同时，通过亚细胞定位实验发现 PPTC7 主要定位于线粒体，且有一部分位于线粒体外膜，这就解释了它为何能与同样位于线粒体外膜的 BNIP3/3L 和 FBXL4 相互作用。
2. PPTC7 调控 BNIP3/3L 蛋白稳定性：研究发现，敲低或敲除 PPTC7 会导致 BNIP3/3L 蛋白稳态水平显著升高，而其 mRNA 水平却下降或不变，这表明 PPTC7 是在转录后水平调控 BNIP3/3L 的蛋白水平。进一步研究发现，PPTC7 敲除细胞中 BNIP3/3L 的半衰期明显延长，内源性泛素化水平显著降低。有趣的是，PPTC7 对 BNIP3/3L 蛋白稳定性的调控并不依赖其蛋白磷酸酶活性，因为过表达野生型 PPTC7（PPTC7-WT）或其酶活性失活的 D78A 突变体，都能同样逆转 PPTC7 缺失导致的 BNIP3/3L 蛋白积累。
3. PPTC7 缺失激活 BNIP3/3L 依赖的线粒体自噬：在细胞实验中，敲低 PPTC7 会导致线粒体标记蛋白水平下降，而单独敲低 BNIP3 或 BNIP3L 只能部分恢复，同时敲低两者则能完全恢复，这表明 PPTC7 通过经典自噬途径调控线粒体含量。利用 Mtphagy Dye 监测线粒体自噬发现，PPTC7 敲除会显著增加线粒体自噬信号，敲低 BNIP3 或 BNIP3L 可部分阻断，同时敲低两者则完全阻断。此外，PPTC7 敲除还会导致细胞的氧消耗率（OCR）和 ATP 生成减少，乳酸生成增加，而同时敲低 BNIP3/3L 能有效逆转这些现象。在 Pptc7 基因敲除小鼠模型实验中，研究人员发现敲除小鼠多种组织中 BNIP3/3L 蛋白水平上调，线粒体蛋白水平下降。在小鼠胚胎成纤维细胞中也观察到类似现象，并且敲低 BNIP3 或 BNIP3L 能部分抑制 Pptc7 敲除诱导的线粒体自噬激活，同时敲低两者则完全阻断。透射电镜观察发现，Pptc7 敲除小鼠的线粒体自噬泡数量显著增加，线粒体面积明显减小，这些结果都表明 PPTC7 缺失会激活 BNIP3/3L 依赖的线粒体自噬。
4. PPTC7 是 SCF^FBXL4 E3 泛素连接酶复合物的必需辅助因子：由于 PPTC7 不具备与泛素 - 蛋白酶体系统相关的结构域，不太可能直接促进 BNIP3/3L 的泛素化和降解。研究发现，在亲本 HeLa 细胞中过表达 PPTC7-WT 或 D78A 突变体，都会使内源性 BNIP3/3L 的稳态水平升高，同时降低线粒体含量；而在 FBXL4 敲除细胞中过表达 PPTC7-WT 则对 BNIP3/3L 蛋白水平和线粒体含量没有影响。同样，过表达 FBXL4 在亲本 HeLa 细胞中有类似作用，但在 PPTC7 敲除细胞中却无此效果。最后，研究还表明共表达 PPTC7-WT 或 D78A 突变体能增强 FBXL4 诱导的 BNIP3/3L 泛素化，这些结果充分说明 PPTC7 是 SCF^FBXL4 E3 泛素连接酶复合物的必需辅助因子，能促进 BNIP3/3L 的泛素化和降解。

综合研究结论和讨论部分，该研究明确了 PPTC7 作为 SCF^FBXL4复合物的关键辅助因子，在调控 BNIP3/3L 依赖的线粒体自噬过程中发挥着不可或缺的作用。这一发现为深入理解线粒体自噬的调控机制提供了新的视角，也为相关疾病的发病机制研究和潜在治疗靶点的开发奠定了坚实基础。不过，目前仍有一些问题有待进一步探索，比如 PPTC7 和 FBXL4 的上游调控机制、它们在不同生理和病理条件下的具体作用差异等。未来的研究可以围绕这些方向展开，有望为相关疾病的治疗带来新的突破。