骨髓间充质干细胞来源的凋亡小泡通过 NAMPT/SIRT1/FOXO1 轴改善后肢缺血：开启治疗新方向

为解决慢性肢体威胁性缺血（CLTI）治疗难题，研究人员探究骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源凋亡小泡（ApoVs）的作用，发现其可通过 NAMPT/SIRT1/FOXO1 轴促进血管生成，为 CLTI 治疗提供新方向。

　　慢性肢体威胁性缺血（CLTI），作为外周动脉疾病（PAD）最严重的阶段，正严重威胁着人们的健康。想象一下，下肢的动脉因动脉粥样硬化变得狭窄、堵塞，腿部的血液循环被无情阻断，肌肉因缺血反复受损，纤维化和线粒体功能障碍接踵而至，患者不仅要承受休息时的疼痛，组织也开始出现坏死，甚至面临截肢的风险。目前，虽然手术和血管内血运重建是治疗 CLTI 的有效手段，但仍有大约 20% 的患者不适合这些治疗。因此，寻找新的治疗策略迫在眉睫。

在这样的背景下，西安交通大学第一附属医院等机构的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦于骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的凋亡小泡（ApoVs），试图探索其对 CLTI 的治疗潜力。最终，研究成果发表在《Stem Cell Research & Therapy》上。该研究发现，移植的 BMSCs 在凋亡过程中释放的 ApoVs 能够促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和血管生成，其主要机制是通过 NAMPT/SIRT1/FOXO1 轴发挥作用。这一发现为 CLTI 的治疗提供了全新的视角和潜在的治疗方向。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，构建了小鼠后肢缺血模型，通过激光多普勒灌注成像、组织学和免疫荧光染色等技术，评估血液流动、组织损伤和血管生成情况。在细胞实验中，培养了人 BMSCs 和 HUVECs，利用流式细胞术（FCM）对 BMSCs 进行表征，采用差速离心法分离 ApoVs，运用蛋白质组学分析、Western blotting、定量实时 PCR（qRT-PCR）等技术探究 ApoVs 对 HUVECs 的作用机制。

下面来看具体的研究结果：

• 移植的 BMSCs 发生凋亡并改善后肢缺血：研究人员首先对人 BMSCs 进行了表征，确认其符合实验要求。随后将 BMSCs 注射到后肢缺血小鼠的腓肠肌中，激光多普勒分析显示，BMSCs 组的血流信号更强，组织学分析也表明其能有效改善组织损伤。但生物发光成像（BLI）和免疫荧光染色发现，BMSCs 在移植后很快发生凋亡。这说明，虽然 BMSCs 能改善后肢缺血，但其在体内的存活时间较短。
• 分离的 ApoVs 促进体内组织修复和血管生成：研究人员诱导 BMSCs 凋亡，成功分离出 ApoVs，并对其进行了表征。将 ApoVs 注射到后肢缺血小鼠体内后发现，ApoVs 能显著改善小鼠后肢缺血情况，促进血管生成和组织修复，且巨噬细胞清除对其治疗效果影响较小。进一步研究发现，ApoVs 在体内的血管生成作用主要源于其与内皮细胞的相互作用。
• ApoVs 促进 HUVECs 的生物学功能：体外实验表明，HUVECs 能够内化 ApoVs。CCK-8 实验、EdU 染色、伤口愈合实验、Transwell 实验和管形成实验等结果显示，ApoVs 能显著增强 HUVECs 的增殖、迁移和血管生成能力，同时 qPCR 分析发现，ApoVs 处理后，HUVECs 中血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素 2（ANG2）等血管生成相关基因的表达显著上调。
• HUVECs 摄取 ApoVs 依赖于动力蛋白、网格蛋白和窖蛋白介导的内吞作用：研究人员通过标记 ApoVs 并使用不同的抑制剂进行实验，发现 20μg/mL 的 ApoVs 在 6h 时摄取效率达到峰值，且 ApoVs 的摄取是一个依赖能量的主动过程。动力蛋白、网格蛋白和窖蛋白介导的内吞作用参与了 HUVECs 对 ApoVs 的摄取，而其他一些途径，如脂质筏、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巨噬体等，对 ApoVs 的摄取没有明显影响。
• 蛋白质组学分析揭示 ApoVs 影响 HUVECs 的分子机制：对 HUVECs 和 HUVECs-ApoVs 进行蛋白质组学分析后发现，ApoVs 处理后，HUVECs 中 607 种蛋白质的表达发生了显著变化。GO 数据库分析显示，上调的蛋白质与信号转导、血管生成等生物学过程密切相关。KEGG 富集分析表明，ApoVs 处理增强了与代谢、炎症、免疫等相关途径中蛋白质的表达。其中，烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的表达显著升高，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）代谢生物合成中的限速酶，与信号转导和血管生成密切相关。
• ApoVs 来源的 NAMPT 通过 NAMPT/SIRT1/FOXO1 轴促进 HUVECs 的生物学功能：研究发现，ApoVs 能使 HUVECs 中 NAMPT 的表达水平呈浓度依赖性增加，同时细胞内 NAD⁺/NADH 比值升高，SIRT1 表达上调，乙酰化的 FOXO1（AC-FOXO1）和 FOXO1 水平降低。免疫荧光染色显示，ApoVs 处理后，FOXO1 从细胞核转移到细胞质，其转录活性降低。通过下调 NAMPT 的表达发现，这会导致 HUVECs 的增殖、迁移和血管生成能力下降，进一步证实了 NAMPT 在 ApoVs 促进 HUVECs 生物学功能中的重要作用。
• ApoVs 通过 SIRT1 促进 HUVECs 的生物学功能：为了确认 SIRT1 对血管生成的影响，研究人员使用特异性 siRNAs 敲低 SIRT1。结果显示，敲低 SIRT1 显著抑制了 ApoVs 刺激的 HUVECs 的增殖、迁移和血管生成能力，同时逆转了 ApoVs 诱导的 AC-FOXO1 和 FOXO1 水平的降低，证明了 SIRT1 在介导 ApoVs 生物学效应中的关键作用。

研究结论表明，BMSCs 移植到缺血后肢后具有持久的治疗效果，主要是因为其在凋亡过程中释放了含有 NAMPT 的 ApoVs。这些 ApoVs 被 HUVECs 摄取，通过 NAMPT/SIRT1/FOXO1 轴促进 HUVECs 的增殖、迁移和血管生成。这一研究为 CLTI 的治疗提供了新的思路，让我们对 BMSCs 治疗 CLTI 的机制有了更深入的理解，也为基于 ApoVs 的治疗方法开辟了新的方向。不过，目前 ApoVs 的临床应用仍面临一些挑战，如 ApoVs 成分复杂，需要开发标准化的分离提取方法；血管生成受多种信号通路调节，还需进一步探索其他相关通路；内源性 ApoVs 的作用和分布也有待进一步研究。但无论如何，这项研究都为未来的研究和治疗提供了重要的基础和方向，有望为 CLTI 患者带来新的希望。