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为探究 Rho1 激活 FKS1 机制，研究人员解析 FKS1 及 FKS1-Rho1 复合物冷冻电镜结构，助力理解真菌细胞壁合成。
在微观的真菌世界里，细胞壁如同坚固的 “铠甲”，守护着真菌细胞。β-1,3 - 葡聚糖（β -1,3-glucan）作为真菌细胞壁的关键 “建材”，对维持细胞壁的稳定和功能起着不可或缺的作用。而 β-1,3 - 葡聚糖合酶（β -1,3-glucan synthase，GS）则是合成这一重要 “建材” 的核心 “工匠”。它由糖基转移酶 FKS1（FK506 supersensitive）和小 GTP 酶 Rho1 组成，其中 FKS1 是催化亚基，负责合成 β -1,3 - 葡聚糖；Rho1 作为调节因子，掌控着 FKS1 的活性。
然而，在这个看似简单的合成过程中，却隐藏着诸多谜题。尽管此前的研究已经明确了 GS 各组分的基本功能，但 Rho1 究竟如何以 GTP 依赖的方式激活 FKS1，这一关键机制仍如同迷雾般笼罩着科研人员。由于缺乏 FKS1-Rho1 复合物的结构信息，科学家们在探索真菌细胞壁合成的道路上遭遇了瓶颈。而这一机制的缺失，也使得开发针对真菌细胞壁合成的新型抗真菌药物变得困难重重。
为了揭开这些谜题，四川大学生殖与妇幼保健教育部重点实验室、天津大学合成生物学前沿科学中心等机构的研究人员展开了深入研究。他们成功解析了 FKS1 在静息状态和与 Rho1 结合的活性状态下的冷冻电镜结构，为理解真菌细胞壁 β -1,3 - 葡聚糖的合成机制提供了关键线索，相关研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，通过 CRISPR-Cas9 系统对酵母 fks 基因进行单敲和双敲，以此确定 fks1 基因在细胞中的关键作用；蛋白质表达和纯化技术，从酵母细胞和昆虫细胞中分别表达并纯化出 FKS1 和 Rho1 蛋白，为后续实验提供物质基础；冷冻电镜技术，采集 FKS1 及 FKS1-Rho1 复合物的冷冻电镜数据，解析其结构；还有生化分析技术，利用多种实验检测 FKS1 的活性、蛋白质间的相互作用等 。
下面来看具体的研究结果：
- fks1 基因的功能验证：酿酒酵母中存在 fks1、fks2 和 fks3 三个基因编码 GS 的催化亚基。研究人员运用 CRISPR-Cas9 系统进行基因敲除实验，发现 fks1 和 fks2 双敲菌株无法存活，而 fks1 单敲菌株的细胞壁组成发生改变，尤其是葡萄糖与甘露糖的比例变化明显。这一结果突出了 fks1 在细胞壁合成中的关键地位。
- FKS1 的结构解析：研究人员构建了带有标签的酵母菌株，纯化出全长 FKS1 蛋白。经 SEC 实验和活性检测，证实成功制备出有功能的 FKS1 和 Rho1 蛋白。随后，解析出 FKS1 的冷冻电镜结构，分辨率达 3.16 ?，其结构属于 GT48 家族的 GT-A 型糖基转移酶，包含 15 个跨膜螺旋和大的胞质结构域，可能代表静息状态。同时，确定了 FKS1 的活性位点关键残基，突变这些残基会影响细胞壁中葡萄糖与甘露糖的比例及菌株生长，还发现 AC 结构域与 GT 结构域的相互作用对 FKS1 活性至关重要。
- 体外重组 GS：通过 Flag pulldown 和活性实验，证实 FKS1 与 Rho1 直接相互作用，且 GTPγS 可增强二者结合及 GS 激活。Rho1 的 Q68H 组成型激活突变可使 FKS1 在无 GTPγS 时被激活。由于内源性 GS 复合物难以纯化，研究人员体外重组 GS 复合物，并通过 BS3 交联实验验证了 Rho1Q68H与 FKS1 的直接相互作用。
- FKS1-Rho1 复合物的结构：收集 FKS1-Rho1 非交联和交联样本的冷冻电镜数据，最终解析出分辨率为 3.40 ? 的复合物结构。该结构显示 Rho1 单体位于 FKS1 的胞质裂隙中，处于 GT 结构域和四个侧向螺旋之间，这一结构暗示 Rho1 可能诱导 GT 结构域发生构象变化，且该复合物代表了 GS 的活性状态。
- Rho1 与 FKS1 结合的分子基础：研究发现 GTP 能增强 Rho1 与 FKS1 的结合，二者主要通过 α3 螺旋区域的亲水相互作用结合，关键残基包括 Rho1 的 α3 螺旋中的 E98、E102、Q113 和 FKS1 的 RIL 环中的 Q1516、H1518 等。突变这些关键残基会影响 FKS1 的结合和活性，揭示了 Rho1 与 FKS1 结合的偏好性及相互作用机制。
- 激活的 Rho1 诱导 FKS1 构象变化：对比 FKS1 的静息态和与 Rho1 结合的活性态结构，发现跨膜螺旋 TM7-TM15 和 GT 结构域发生显著构象变化，这种变化可能有助于糖链延伸并推出 FKS1 的膜通道。
综合研究结果，研究人员对真菌细胞壁 β -1,3 - 葡聚糖的合成机制有了更深入的理解。在 FKS1 的静息状态下，AC 结构域和 GT 结构域紧密结合，维持 FKS1 的活性。Rho1 通过与 FKS1 的相互作用，在 GTP 的调控下，诱导 FKS1 发生构象变化，促进 β -1,3 - 葡聚糖的合成。基于这些发现，研究人员提出了一个 “棘轮和棘爪” 机制模型，解释 Rho1 对 FKS1 活性的动态调节过程。
这项研究成果意义重大，它为深入理解真菌细胞壁合成机制提供了重要依据，揭示的关键残基、结构域和相互作用界面，为进一步研究 FKS1-Rho1 复合物的激活过程和寻找潜在药物靶点奠定了基础，有望推动新型抗真菌药物的研发，为解决真菌感染相关疾病带来新的希望 。
