一种精准检测实体瘤基因融合的 DNA 和 RNA 靶向测序法：开启肿瘤精准诊疗新篇章

为准确检测肿瘤基因融合，研究人员开发 DNA 和 RNA 联合的二代测序（NGS）法，该法在 FFPE 样本中性能卓越，助力精准诊疗。

　　肿瘤，这个威胁人类健康的 “恶魔”，一直是医学领域重点攻克的难题。基因融合作为肿瘤重要的分子生物标志物，在肿瘤的诊断、分类以及靶向治疗中都有着举足轻重的地位。打个比方，基因融合就像是肿瘤细胞里的 “秘密指令”，指挥着肿瘤的生长、发展。检测出这些 “指令”，医生就能更准确地判断病情，为患者量身定制合适的治疗方案。

然而，目前检测基因融合的传统方法，如免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH），就像有着 “短板” 的水桶。它们虽然在临床应用广泛，但无法同时检测多个融合基因，在诊断不明确时，难以满足临床需求。二代测序（NGS）技术的出现，本是带来了新希望，可无论是基于 DNA 的 NGS，还是基于 RNA 的 NGS，都存在各自的挑战。基于 DNA 的 NGS 需要覆盖大片段基因组来确保结果准确，而基于 RNA 的 NGS，在处理福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本时，容易受到化学修饰、氧化变性和 RNA 降解的影响，导致后续检测困难。并且，市面上多数临床应用的商业基因检测试剂，只依赖 DNA 或 RNA 的 NGS 来检测基因融合，不仅容易出现漏检或误检，高昂的成本还让患者和医保体系压力倍增。

为了突破这些困境，复旦大学附属肿瘤医院的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们精心设计并验证了一种定制化的检测方法，将基于 DNA 和 RNA 的 NGS 技术相结合，用于实体瘤中基因融合的检测。最终，这项研究成果发表在《Scientific Reports》上。研究表明，该联合检测方法在 FFPE 样本检测中表现优异，不同层面的检测结果能够相互补充，为肿瘤的精准诊断和治疗提供了有力支持。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，从 68 个样本（包含 8 个商业融合掺入参考标准品和 60 个临床 FFPE 样本）入手开展研究。接着进行 panel 设计，筛选出 16 个与癌症相关融合基因。之后，提取样本中的基因组 DNA 和总 RNA ，并进行文库制备和测序。最后，对测序数据运用特定算法进行分析 。

下面来看看具体的研究结果：

• DNA 和 RNA 测序检测方法开发概述：研究人员制定了融合基因检测方法开发和验证的流程，该流程分为技术验证（使用参考标准品）和临床验证（使用临床 FFPE 样本）两部分。
• DNA 和 RNA 测序流程经参考标准品充分验证：研究人员购买了含有 10 种融合基因的 DNA 和 RNA 融合参考标准品，通过系列稀释实验评估突变丰度对融合检测的影响。结果显示，EML4^::ALK、CD74^::ROS1 和 CCDC6^::RET 融合在所有稀释度下的重复检测中均能被识别；SLC34A2^::ROS1 融合在 RNA 水平可稳定检测，但在 DNA 突变丰度 2.5% 时，5 次重复检测中有 3 次读数少于 5。这表明不同融合基因的检测灵敏度存在差异。同时，确定该检测方法在 DNA 突变丰度低至 5%、RNA 为 250 - 400 copies/100 ng 时，仍可稳定检测融合基因。
• 基于临床样本的验证：研究人员选取 60 个样本（30 个融合阳性，30 个融合阴性）评估检测方法的临床实用性。这些样本先前已通过 NGS 或 FISH 确定融合状态。研究发现，该检测方法灵敏度达 100%，特异性为 96.9%。经校准后，特异性可达 100%。从 DNA 或 RNA 单独检测结果来看，DNA 检测与先前结果的一致性为 93.4%，RNA 检测为 86.9%，二者结果可相互补充。此外，通过对三个样本的评估发现，该联合检测方法的批内和批间重复性良好，能稳定用于 FFPE 样本的基因融合检测。

在讨论部分，研究人员指出，目前中国尚无同时检测 DNA 和 RNA 水平基因融合的获批商业试剂盒，临床基因检测对院内检测流程的开发提出了需求。他们开发的检测方法主要针对激酶基因，如 ALK、ROS1、RET 和 NTRK 基因，有助于识别治疗靶点，还可辅助软组织肿瘤等的鉴别诊断。尽管同时使用 DNA 和 RNA 测序会增加成本和检测时间，但二者结果相互补充，能更清晰可靠地反映分子特征。在验证集中，DNA 和 RNA 检测结果的不一致率为 19.7%，原因包括肿瘤含量低、核酸降解、探针设计难以覆盖某些区域以及复杂的生物学机制等。

总的来说，这项研究开发的基于 DNA 和 RNA 的 NGS 联合检测方法，在 FFPE 样本检测中展现出卓越性能。从质量和成本角度来看，为院内实体瘤基因融合检测带来了显著提升，为肿瘤的精准诊断和个性化治疗提供了更精准、更经济的检测方案，在肿瘤诊疗领域具有重要的应用价值，有望推动肿瘤精准医学的进一步发展。