超高效液相色谱 - 轨道阱高分辨质谱法：助力硫酸脑苷脂相关疾病诊断

研究人员为解决硫酸脑苷脂（SM4）相关疾病诊断难题，开展相关研究，发现 6 种硫酸脑苷脂可诊断 MLD 和严重 MSD。

　　硫酸脑苷脂（Sulfatides，3-O-Sulfogalactosylceramide，SM4，又称糖鞘脂硫酸盐），是一类由硫酸化半乳糖与神经酰胺（鞘氨醇碱基和脂肪酸）相连构成的代谢产物 。它在人体中扮演着极为重要的角色，尤其在髓鞘结构中含量丰富，参与维持髓鞘的正常功能，同时还涉及免疫系统、止血 / 血栓形成、葡萄糖代谢等多种生物学过程，与癌症、微生物感染等也存在密切联系。然而，硫酸脑苷脂代谢异常会引发一系列严重疾病，其中异染性脑白质营养不良（Metachromatic Leukodystrophy，MLD）和多种硫酸酯酶缺乏症（Multiple Sulfatase Deficiency，MSD）最为典型。

MLD 是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积症，主要由芳基硫酸酯酶 A（arylsulfatase A，ARSA）或（罕见情况下）鞘脂激活蛋白 B（saposin B）缺乏所致。这会导致硫酸脑苷脂在溶酶体内异常蓄积，进而引发中枢和周围神经系统的脱髓鞘以及炎症反应，产生认知障碍、精神行为问题、步态异常等一系列神经系统症状，严重影响患者生活质量，甚至危及生命。MSD 则是由于硫酸酯酶翻译后激活过程中，甲酰甘氨酸生成酶（formylglycine generating enzyme，FGE）功能受损，致使 17 种细胞内硫酸酯酶（包括 ARSA）均受到影响，患者会出现进行性神经系统疾病和神经退行性变，同时伴有全身疾病症状，且目前尚无有效治疗方法。

目前，硫酸脑苷脂相关疾病的诊断面临诸多挑战。一方面，MLD 和 MSD 早期症状不典型，如发育迟缓、行为问题或精神症状等，容易造成误诊和漏诊，导致诊断延迟，而早期诊断对疾病治疗至关重要，一旦错过最佳治疗时机，患者将面临不可逆的神经损伤 。另一方面，现有的硫酸脑苷脂检测方法存在局限性。传统方法如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）或三重四极杆质谱法（LC-MS/MS），在检测硫酸脑苷脂时，存在特异性差、无法准确识别不同分子种类、易受共洗脱物质离子抑制干扰等问题。此外，样本前处理过程繁琐，如 LC-MS/MS 需要进行液 - 液萃取和样品净化，不仅耗时费力，还可能影响检测结果的准确性。因此，开发一种准确、高效的硫酸脑苷脂检测方法迫在眉睫。

为了解决上述难题，来自荷兰乌得勒支大学医学中心（University Medical Center Utrecht，UMCU）等机构的研究人员开展了一项研究，旨在建立一种新的检测方法用于定量尿液中的硫酸脑苷脂分子种类，以辅助 MLD 和 MSD 的诊断。相关研究成果发表在《Analytica Chimica Acta》上。

研究人员主要运用了超高效液相色谱 - 轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Orbitrap-HRMS）进行研究。样本队列来源于 UMCU 代谢诊断科留存的剩余尿斑样本，包括健康对照者（n = 133）、MLD 患者（n = 10，21 个样本）、MSD 患者（n = 4）以及患有粘脂贮积症 II 型（mucolipidosis type II，ML II）的患者样本，同时还纳入了来自德国图宾根和哥廷根的相关患者样本。

在研究过程中，研究人员首先对尿液中的硫酸脑苷脂进行了全面的指纹图谱分析（screening），成功鉴定出 48 种硫酸脑苷脂分子种类。随后，基于诊断效用和丰度，从这 48 种中筛选出 6 种硫酸脑苷脂（d18:1 连接的 C22:0、C22:0-OH、C24:0、C24:0-OH、C24:1-OH 和 C26:1-OH）进行半定量分析。通过对不同年龄和胎龄的样本进行检测，研究人员建立了这 6 种硫酸脑苷脂的年龄和胎龄特异性参考范围。

在硫酸脑苷脂的表征方面，研究人员利用数据依赖性 MS²实验对已知的 C24 硫酸脑苷脂进行碎片化分析，并与参考数据对比，确认了其化学结构。同时，根据碎片离子特征，还成功鉴定出其他具有不同侧链长度和饱和度的硫酸脑苷脂种类。然而，在检测过程中发现，在 m/z 908.65022 处，除了 d18:0/C24:0-OH 外，还存在一个未鉴定的峰，该峰在对照和患者尿液中均存在，但由于未纳入诊断用的 6 种硫酸脑苷脂 panel，故未作进一步研究。

通过对 48 种硫酸脑苷脂进行谱图分析，研究人员发现，健康个体尿液中硫酸脑苷脂排泄量较低或难以检测，而 MLD 患者尿液中多种硫酸脑苷脂分子种类显著升高。同时，研究还发现硫酸脑苷脂的排泄量与年龄相关，随着年龄增长，总硫酸脑苷脂排泄量逐渐降低；在新生儿中，胎龄与硫酸脑苷脂排泄量和组成也存在关联，胎龄增加，总硫酸脑苷脂排泄量减少，且不同胎龄阶段，C24 不饱和和羟基化硫酸脑苷脂存在差异。

对选定的 6 种硫酸脑苷脂进行半定量分析及方法学验证后，研究人员发现，该方法在检测 MLD 和严重 MSD 时具有良好的准确性、精密度、选择性和线性范围，最低定量限（LLOQ）也能满足检测需求。在临床应用评估中，研究人员发现，所有 MLD 患者（包括治疗和未治疗的患者）尿液中硫酸脑苷脂排泄量均显著增加，且与健康对照者有明显区分；在 MSD 患者中，严重临床表现的患者硫酸脑苷脂排泄量显著升高，而症状较轻的患者排泄量正常，这与患者体内 ARSA 残留活性水平有关。此外，研究人员还发现，对于 ML II 患者，之前报道的硫酸脑苷脂排泄量增加情况在本次研究中未得到证实，该患者尿液中硫酸脑苷脂排泄量正常。

为了提高诊断的准确性，研究人员进一步探索了潜在的辅助诊断指标。他们发现，饱和脂肪酸硫酸脑苷脂与羟基脂肪酸硫酸脑苷脂的比值，如 (d18:1/C22:0 + d18:1/C24:0)/(d18:1/C22:0-OH + d18:1/C24:0-OH)，有助于区分 MLD 患者和对照者，可减少因新生儿硫酸脑苷脂排泄量较高而导致的假阳性结果。同时，d18:1/C26:1-OH 在 MLD 和严重 MSD 患者尿液中排泄量显著高于对照者，可作为潜在的诊断标志物，但需要进一步研究以验证其特异性。

尽管该研究取得了重要成果，但也存在一定局限性。例如，由于缺乏所有硫酸脑苷脂种类的同位素标记标准品，研究中仅使用了两种内标（d18:1/C17 和 d18:1/C24:1-d₇）来定量 48 种硫酸脑苷脂异构体，这可能影响定量的准确性和可靠性；生活方式因素如饮食可能影响硫酸脑苷脂排泄；早产儿硫酸脑苷脂组成随年龄变化的情况尚未完全明确；MSD 患者样本量较小，限制了对该疾病的深入研究。

总体而言，该研究成功开发了一种基于 UHPLC-Orbitrap-HRMS 的尿液硫酸脑苷脂半定量检测方法，并建立了年龄匹配的对照参考范围。研究表明，6 种硫酸脑苷脂（C22:0、C24:0、C22:0-OH、C24:0-OH、C24:1-OH 和 d18:1/C26:1-OH 连接到 d18:1 硫酸脑苷脂主链）可作为 MLD 和严重 MSD 的通用诊断工具，饱和 C22 和 C24 硫酸脑苷脂及其羟基化物种的比值有助于减少诊断中的假阳性结果。此外，该方法不仅可用于 MLD 和 MSD 的诊断，还可能应用于其他硫酸脑苷脂排泄异常相关疾病的诊断，为临床诊断和疾病研究提供了有力的技术支持，具有重要的临床意义和应用价值。未来，随着研究的深入，有望进一步完善该检测方法，提高对硫酸脑苷脂相关疾病的诊断和治疗水平。