重组腺相关病毒（AAV）衣壳变体在不同小鼠品系和食蟹猴中趋向性的差异研究

该研究构建含 21 种衣壳变体的条形码 AAV 文库，探究其在不同小鼠品系和食蟹猴中的趋向性差异。

　　

在生命科学和医学研究领域，重组腺相关病毒（AAV）作为基因递送和基因治疗的有力工具，正受到越来越多的关注。AAV 是一种 DNA 病毒，最初在感染腺病毒的恒河猴肾细胞培养物中被发现。随着时间的推移，多种野生型 AAV 血清型被发现并应用于基因治疗领域，目前已有 7 种基于 AAV 的药物获得批准。此外，近年来还开发出了各种经过工程改造的 AAV 衣壳，这些衣壳相较于野生型衣壳展现出不同的趋向性，进一步拓宽了 AAV 在基因递送方面的应用范围。

然而，不同 AAV 衣壳变体在不同小鼠品系（如 C57BL/6 小鼠、BALB/c 小鼠）以及小鼠与非人灵长类动物（NHPs）之间，表现出明显不同的转导模式。例如，AAV - PHP.B 在 C57BL/6 小鼠的中枢神经系统（CNS）中具有较高的转导效率，但在 BALB/c 小鼠和 NHPs 中的效率却较低。而且，AAV 在小鼠肝脏中能够维持较高且稳定的转基因表达，而在灵长类动物肝脏中，载体 RNA 的丰度却显著较低。这种不一致性凸显了全面研究和比较 AAV 在不同小鼠品系和 NHPs 中趋向性的重要性。

为了深入探究 AAV 趋向性在不同物种间的差异，研究人员构建了包含 21 种衣壳变体的条形码 AAV 文库。这些衣壳变体包括 AAV1 - AAV9、rh10、rh74、DJ（即 LK03）、B1、HSC15、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、CAP - B10 和 MyoAAV - 2A 等。研究人员采用条形码测序方法，为每种衣壳变体设计了独特的条形码标识。具体来说，构建了一系列名为 Barcode2 - CAG - H2B - tdTomato - WPRE - Barcode1 - SV40polyA 的条形码构建体，每对 Barcode1 和 Barcode2 由不同的 7 聚体标识符组成，代表单个 AAV 衣壳，用于评估潜在的测序偏差。

研究人员将构建好的 AAV 文库分别静脉注射到 C57BL/6 小鼠、BALB/c 小鼠和食蟹猴体内。在注射后 3 周，收集小鼠的 20 种组织以及食蟹猴的 28 种组织，从 DNA、RNA 和蛋白质水平评估 AAV 的趋向性。

在比较 C57BL/6 小鼠和 BALB/c 小鼠时发现，虽然两种小鼠体内 AAV 载体 DNA 的丰度没有显著差异，但在 BALB/c 小鼠的某些组织（如大脑、脊髓、小脑、肺和骨髓）中，mRNA 丰度明显低于 C57BL/6 小鼠。通过检测组织中的 tdTomato 信号也证实了这一结果，在 BALB/c 小鼠的大脑、脊髓、肺和骨髓中，tdTomato?细胞的百分比显著低于 C57BL/6 小鼠。进一步分析每种 AAV 衣壳变体在两种小鼠品系中的趋向性差异发现，AAV9、PHP.B、PHP.eB 和 CAP - B10 等衣壳变体的转导模式差异较大。以 AAV - PHP.B 为例，它在 BALB/c 小鼠的中枢神经系统以及其他多种组织（如肝脏、心脏、脂肪组织和肺）中的转导效率均低于 C57BL/6 小鼠，表明其在 BALB/c 小鼠中的整体转导效率有所下降。

在比较 C57BL/6 小鼠和食蟹猴时，研究人员考虑到食蟹猴体内可能存在针对多种 AAV 衣壳的预先存在的中和抗体（NAb），且 AAV 输注后可能引发较高的适应性免疫反应，因此采用了 g3T 细胞和 B 细胞抑制方案（每日 2mg/kg 雷帕霉素和每周 20mg/kg 利妥昔单抗）来抑制抗衣壳或抗转基因免疫反应。结果发现，食蟹猴体内大多数组织中 AAV 载体 DNA 的丰度与 C57BL/6 小鼠相当，但在 28 种组织中有 20 种组织的 AAV RNA 丰度显著低于 C57BL/6 小鼠。通过检测 tdTomato 信号也发现，在食蟹猴的肝脏、心脏、肌肉和中脑等组织中，tdTomato 染色明显低于 C57BL/6 小鼠。对不同衣壳变体的转导模式进行比较发现，AAV4、AAV5、PHP.B、PHP.eB、CAP - B10 和 MyoAAV - 2A 等衣壳在小鼠和食蟹猴之间的转导差异较大。例如，AAV4 在 C57BL/6 小鼠的肝脏、肺、心脏、肌肉和脂肪组织等多种组织中具有较高的转导效率，但在食蟹猴中，其整体转导模式较为均匀且效率较低，显示出与小鼠明显不同的趋向性模式。

基于对 21 种衣壳变体转导效率的评估，研究人员确定了在不同物种中针对特定组织的最有效 AAV 衣壳。在肝脏转导方面，AAVrh10 和 AAVrh74 在小鼠和食蟹猴中均表现出较高的效率，但像 AAV - DJ 仅在小鼠中具有高转导效率，AAV6.2FF 和 LK03 则仅在食蟹猴的肝脏中表现出强靶向性。在肌肉、心脏和膈肌的转导中，MyoAAV - 2A 在小鼠和食蟹猴中效率最高，AAV9 和 AAVHSC15 也表现出明显的肌肉趋向性。在中枢神经系统的转导中，AAV9 和 PHP.S 在小鼠和食蟹猴的大脑转导中效率最高，一些从 AAV9 改造而来以增强神经趋向性的衣壳变体，如 PHP.B、PHP.eB 和 CAP - B10，在食蟹猴的大脑、小脑和脊髓中的转导效率与 AAV9 相比，没有明显的提高或降低。此外，研究还发现 AAV4 在肺、肾和胰腺的基因递送中表现出色，AAV9 则在胰腺、胃、肠、结肠和睾丸的基因递送中效率最高。

进一步对 AAV4 和 AAV9 进行单独研究发现，AAV4 在小鼠和食蟹猴中均表现出独特的肝脏去靶向模式。与 AAV9 相比，AAV9 在小鼠的肝脏中载体 DNA 丰度最高，而 AAV4 的载体 DNA 在肝脏中的丰度较低，呈现出肝脏去靶向的特点。在 RNA 表达和转导效率方面，AAV9 在肝脏、棕色脂肪组织和睾丸间质中的转导效率明显高于 AAV4，而 AAV4 在肺、胰岛和肾小球中的转导效率则显著高于 AAV9。例如，在肺组织中，AAV4 感染后的 tdTomato?细胞百分比为 21.23% ± 0.88%，而 AAV9 仅为 1.73% ± 0.24%。

综合以上研究结果，该研究系统地揭示了不同小鼠品系以及小鼠和食蟹猴之间 AAV 转导的显著差异。AAV 趋向性在不同物种和品系间存在广泛的变化，这可能与 AAV 受体的表达差异、宿主防御途径和免疫系统的不同、启动子的选择以及内质网应激等多种因素有关。根据这些发现，研究人员提出了一些可能提高 AAV 介导的灵长类动物基因治疗效率和持续时间的策略，如调节免疫系统反应、选择合适的启动子、调整翻译元件和增强 AAV 基因组整合等。

不过，该研究也存在一些局限性。首先，在 AAV 转导效率较低的组织中，条形码测序结果的可靠性可能会受到影响，因为当初始 PCR 模板低于 1E3 拷贝 / 反应时，测序结果的稳健性不足，部分食蟹猴组织中的初始 cDNA 拷贝数接近这一水平。其次，研究使用的是普遍存在的 CAG 启动子来评估 AAV 在多种组织中的全身表达，不同的启动子可能会影响 AAV 趋向性的结果，未来研究可以探索由组织特异性和细胞特异性启动子驱动的 AAV 表达。再者，在研究开始后，又开发出了一些具有独特趋向性的新型 AAV 衣壳变体，如 9P31、MaCPNS1/MaCPNS2、AAV - MG47 和 CPP.16 等，对这些衣壳变体趋向性的研究将是未来的一个有价值的方向。最后，由于很难选择到对所有 AAV 衣壳变体都没有预先存在抗体的食蟹猴，研究中纳入的食蟹猴体内存在针对不同 AAV 衣壳的预先存在的中和抗体，这可能会影响研究结果。

尽管存在这些局限性，该研究仍然为 AAV 在基因递送和治疗领域的应用提供了重要的参考。通过全面探究多种衣壳变体在不同物种和品系中的趋向性差异，研究人员编制了一份适用于靶向特定器官递送的 AAV 衣壳列表，这对于针对特定器官的基因递送和治疗具有潜在的重要意义，为后续的基因治疗研究和临床应用奠定了坚实的基础。