肝靶向 AAV8 介导的 ATP7B 基因疗法对 Wilson 病 Atp7bR780L敲入小鼠模型的疗效和安全性研究

本文构建 Atp7bR780L敲入小鼠模型，探究 AAV8-ΔC4ATP7B 基因疗法对 Wilson 病的疗效与安全性。

　　

一、引言

Wilson 病（WD；OMIM 277900）是一种常染色体隐性遗传疾病，由铜转运 ATP 酶 β（ATP7B）基因突变引起。ATP7B基因突变导致 ATP7B 蛋白缺乏，使得铜（Cu）在肝脏、大脑、肾脏等器官中过量积累，引发铜代谢紊乱。WD 患者铜稳态受损，表现为血清铜蓝蛋白水平降低、尿铜排泄增加、铜在体内过量积累、肝脏炎症和纤维化。WD 可在任何年龄发病，临床表现多样，从无症状的转氨酶升高到严重的肝脏疾病（如肝硬化、肝衰竭）、神经系统症状和肾脏疾病等，少数病例还会出现心脏疾病、内分泌症状和肌肉骨骼损伤，若不治疗会危及生命。

WD 全球患病率约为 1/20,000 - 1/10,000，亚洲人群患病率高于西方国家。在大多数欧洲国家，ATP7B基因的 H1069Q 变异较为常见，等位基因频率在 15% - 72%；而在多数亚洲国家，最常见的变异是 R778L，等位基因频率为 13% - 56%。

目前，WD 的治疗策略主要是通过锌剂和低铜饮食减少铜的吸收，利用铜螯合剂增加尿铜排泄，对于严重的肝衰竭或肝硬化患者，则需进行肝移植。但现有治疗方法并非对所有患者有效，存在反应不佳、不耐受、过敏和依从性差等问题，且长期并发症也是一大难题，因此急需更有效的替代疗法。

近年来，基于肝靶向腺相关病毒（AAV）载体的基因疗法在 WD 治疗方面展现出巨大潜力。已有研究将 AAV 介导的人ATP7B（hATP7B）导入 WD 小鼠肝脏，证实其能挽救肝脏铜稳态。然而，ATP7B基因全长加上启动子和 poly (A) 信号超出了 AAV 载体的有效载荷大小，导致生产产量较低。此外，目前 AAV 基因疗法还面临肝脏中转基因表达效率和持久性、引入外源 DNA 引发免疫反应和肝损伤风险等挑战。

本研究构建了一种模拟亚洲 WD 患者中最常见ATP7B基因突变（c.2333G>T (p.R778L)）的Atp7b^R780L敲入（KI）小鼠模型，并设计了一种表达截短型hATP7B蛋白的新型 AAV8 载体（AAV8-ΔC4ATP7B），进一步探究其对 WD 的治疗效果和安全性。

二、Atp7b^KI/KI小鼠重现 WD 铜代谢受损特征但仅发生轻度肝脏疾病

研究人员构建了Atp7b^R780L KI 小鼠模型来模拟人类 WD 的ATP7B R778L 变异。Atp7b^KI/KI小鼠在外观、体重增长和寿命方面与野生型（Atp7b^+/+）小鼠相似，且各年龄组的铜代谢生物标志物无性别差异，因此后续实验按基因型和年龄分组。

与年龄匹配的Atp7b^+/+小鼠相比，Atp7b^KI/KI小鼠从 4 - 6 周龄开始，血清铜蓝蛋白水平极低，肝脏铜含量和尿铜排泄增加。Atp7b^KI/KI小鼠血清铜蓝蛋白峰值为 3.4 IU/L，而Atp7b^+/+小鼠为 37.7 IU/L；Atp7b^KI/KI小鼠肝脏铜含量在 98.8 - 1,020.9 μg/g 干肝组织之间，是Atp7b^+/+小鼠（7.6 - 27.1 μg/g 干肝组织）的 20 - 40 倍；35 - 40 周龄时，Atp7b^KI/KI小鼠肾脏和大脑中也检测到高铜含量；Atp7b^KI/KI小鼠尿铜排泄在 227.3 - 714.8 ng/24 h 之间，显著高于年龄匹配的Atp7b^+/+小鼠。Timm 硫化银染色显示，Atp7b^KI/KI小鼠肝脏有广泛的铜沉积，且分布不均，与年龄相关。

尽管Atp7b^KI/KI小鼠铜稳态严重受损，但它们仅发生轻度肝脏疾病，终生未出现神经损伤。35 - 40 周龄时，Atp7b^KI/KI小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和白蛋白（ALB）水平仍保持正常。随着年龄增长，Atp7b^KI/KI小鼠肝脏炎症细胞浸润明显增加，35 - 40 周龄时与Atp7b^+/+小鼠相比有统计学差异；Masson 染色显示，Atp7b^KI/KI小鼠肝脏纤维化比Atp7b^+/+小鼠更严重。这些结果表明，Atp7b^KI/KI小鼠重现了 WD 铜代谢受损的关键特征，发生了轻度肝脏炎症，但肝功能保持正常，呈现出 WD 的轻度疾病表型。

三、AAV8-ΔC4ATP7B 治疗小鼠中转基因表达主要分布在肝脏

为实现hATP7B基因在肝脏的高效靶向表达，研究人员从两方面设计了新型 AAV 载体：一是选择短的肝脏特异性启动子和人工设计的 poly (A) 加尾信号，将 ITR - 启动子 - ATP7B - polyA - ITR 序列长度控制在 5.1 kb 内；二是根据先前研究，删除 ATP7B 蛋白序列中六个铜离子结合序列中的前四个，保留 N 端的 63 个氨基酸。由此产生了编码密码子优化的截短型hATP7B蛋白（少于 1,100 个氨基酸）的人工 cDNA，即 ΔC4ATP7B。构建了质粒 pFB - AAV8 - LP15 - ΔC4ATP7B 用于重组 AAV 包装（AAV8-ΔC4ATP7B），使hATP7B在肝脏特异性启动子的控制下表达。

为研究 AAV8-ΔC4ATP7B 给药是否能实现肝脏靶向转基因表达并恢复受损的铜稳态，研究人员给 10 周龄的两组治疗小鼠分别注射低剂量（1.5×10¹²载体基因组 [vg]/kg）和高剂量（5.0×10¹² vg/kg）的 AAV8-ΔC4ATP7B。定量聚合酶链反应（qPCR）证实了 ΔC4ATP7B 的表达呈剂量依赖性且具有肝脏特异性；治疗 8 周后，AAV 载体基因组拷贝数也主要局限于肝脏，而非大脑、肾脏、心脏、肺、脾脏和肌肉；蛋白质免疫印迹（Western blot）进一步证实，治疗 8 周后，Atp7b^KI/KI小鼠中 ΔC4ATP7B 蛋白的表达呈剂量依赖性。

四、AAV8-ΔC4ATP7B 疗法挽救 Atp7b^KI/KI小鼠受损的铜代谢并逆转肝脏组织病理学变化

为评估 AAV8-ΔC4ATP7B 疗法的疗效，研究人员将 10 周龄的Atp7b^KI/KI小鼠分为两组，分别接受低剂量（1.5×10¹² vg/kg）和高剂量（5.0×10¹² vg/kg）的 AAV8-ΔC4ATP7B 治疗。年龄匹配的未治疗Atp7b^KI/KI小鼠作为疾病对照组，年龄匹配的Atp7b^+/+小鼠作为健康对照组，检测Atp7b^KI/KI小鼠注射 AAV8-ΔC4ATP7B 后铜代谢受损的关键参数和肝脏组织病理学变化。

单次注射 AAV8-ΔC4ATP7B 8 周后，治疗组Atp7b^KI/KI小鼠血清铜蓝蛋白恢复正常，肝脏铜含量、尿铜排泄和肝脏铜沉积显著降低，但肾脏和大脑铜含量、炎症细胞浸润以及肝脏 Masson 染色结果与未治疗的Atp7b^KI/KI小鼠相比无显著变化。

为评估 AAV8-ΔC4ATP7B 疗法的长期效果，研究人员用单次高剂量（5.0×10¹² vg/kg）的 AAV8-ΔC4ATP7B 治疗 10 周龄的Atp7b^KI/KI小鼠，并在治疗 30 周后处死。结果显示，治疗组Atp7b^KI/KI小鼠血清铜蓝蛋白正常化，肝脏铜含量、尿铜排泄和肝脏铜沉积减少；与治疗 8 周的短期结果不同，治疗 30 周后，治疗组Atp7b^KI/KI小鼠的炎症细胞浸润和肝脏纤维化程度低于未治疗小鼠；此外，治疗组Atp7b^KI/KI小鼠肾脏铜水平降低，且显著低于未治疗小鼠，而大脑铜水平保持不变。这些结果表明，AAV8-ΔC4ATP7B 基因疗法能使治疗的Atp7b^KI/KI小鼠血清铜蓝蛋白完全且持续正常化，减少肝脏铜积累，降低尿铜排泄，逆转肝脏组织病理学变化。

五、AAV8-ΔC4ATP7B 在治疗 Atp7b^KI/KI小鼠中显示出长期安全性

为研究 AAV8-ΔC4ATP7B 疗法的安全性，研究人员分析了治疗后 8 周和 30 周时Atp7b^KI/KI小鼠的体重、血清 ALT 和血清 ALB 等参数。接受 AAV8-ΔC4ATP7B 治疗的Atp7b^KI/KI小鼠在外观和体重增长方面与未治疗的Atp7b^KI/KI小鼠及Atp7b^+/+对照小鼠相似；治疗 8 周后，Atp7b^KI/KI小鼠血清 ALT 水平短暂升高，30 周后恢复到正常范围（10.06 - 96.47 U/L）；在整个实验期间，所有治疗的Atp7b^KI/KI小鼠血清 ALB 水平均维持在正常范围内。

由于 AAV 介导的基因疗法有引发肝细胞癌的潜在风险，研究人员对治疗 30 周后的Atp7b^KI/KI小鼠肝脏进行苏木精 - 伊红（H&E）染色，未发现治疗组Atp7b^KI/KI小鼠肝脏有异常形态或多形性迹象。

六、讨论

目前 WD 的现有治疗方法要求患者终生坚持服药和低铜饮食，药物依从性和药理副作用限制了 WD 患者的长期预后。重组 AAV 基因疗法在遗传性代谢疾病治疗方面具有巨大潜力，已有多个研究小组报道了 AAV 基因疗法治疗 WD 的概念，且目前有两种 WD 基因疗法正在进行临床试验。但 AAV 治疗 WD 仍面临一些挑战。

其中一个挑战是肝细胞靶向转基因递送和表达的效率。本研究的 AAV 载体构建与以往研究不同，研究人员设计了去除 ATP7B 蛋白中 MBD1 - 4 并保留 N 端 63 个氨基酸的密码子优化序列，并构建了包含 ΔC4ATP7B cDNA 和肝脏特异性启动子（LP15）的 AAV 载体。在相同剂量（1.5×10¹² vg/kg）的 AAV8 载体下，本研究的 ΔC4ATP7B 比以往研究具有更好的治疗效果，能快速使血清铜蓝蛋白正常化，降低肝脏铜含量和尿铜排泄。AAV8-ΔC4ATP7B 治疗Atp7b^KI/KI小鼠的短期（8 周）和长期（30 周）结果均显示血清铜蓝蛋白正常化，肝脏铜显著降低，表明 AAV8-ΔC4ATP7B 能实现hATP7B的持续表达和持续治疗效果，挽救Atp7b KI 小鼠模型的铜稳态。

另一个挑战是 AAV 相关免疫反应的风险。AAV 介导的基因疗法常见的副作用是 AAV 相关的肝损伤，表现为 ALT 水平升高，这可能会加重 WD 患者的肝脏疾病。使用 AAV 时的安全性考虑因临床试验中高剂量 AAV 基因疗法导致的死亡报告而变得更加关键。理想的 WD 基因药物除了能恢复铜稳态外，还应具有高转基因表达效率和低肝毒性风险。本研究中相同剂量（1.5×10¹² vg/kg）的 AAV8 载体比以往研究显示出更显著的治疗效果，表明对长期安全性的担忧较少。尽管治疗的Atp7b^KI/KI小鼠在治疗 8 周后血清 ALT 水平升高，但 30 周后恢复正常，提示用 ΔC4ATP7B 治疗的Atp7b^KI/KI小鼠可能会出现血清 ALT 的短暂升高，其潜在的肝毒性在未来研究中仍需关注。

鉴于 AAV 基因疗法的局限性，非病毒递送载体在基因治疗中的研究也在开展。脂质纳米颗粒（LNPs）是一种具有磷脂层和脂质核心的纳米颗粒，可用于运输药物，已被美国食品药品监督管理局批准用于靶向肝脏，能够将遗传物质递送至非分裂细胞，且免疫原性低于病毒载体，还具有无毒、使用方便等优点。特别是在封装较大的用于治疗的 mRNA 或 DNA 方面，LNPs 比 AAV 更具优势。不过，LNPs 也存在生物降解困难等局限性，可能引发潜在的肝毒性。虽然多项研究已证明基于 LNP 的疗法对肝脏疾病有效，但尚未应用于 WD 治疗。未来研究可尝试用 LNPs 递送完整的人ATP7B来挽救 WD 患者受损的铜稳态。

本研究构建的携带Atp7b^R780L变异的Atp7b KI 小鼠模型，与野生型对照小鼠相比，纯合的Atp7b^KI/KI小鼠血清铜蓝蛋白显著降低，肝脏铜严重积累，尿铜排泄增加，成功重现了人类 WD 患者铜代谢紊乱的关键特征。与先前报道的动物模型不同，该模型 ALT 水平正常，肝组织病理变化轻微，这有利于评估基因治疗后药物相关的副作用。

尽管小鼠并非评估 AAV 基因疗法肝脏靶向毒性和免疫原性的理想实验模型，但其他 WD 动物模型（如 LEC 大鼠和拉布拉多寻回犬）往往早期就会发展为严重肝脏疾病并很快死亡，不适合用于临床前研究。因此，本研究新构建的Atp7b KI 小鼠模型为探索铜稳态的病理机制、监测治疗反应以及药物相关肝脏疾病的初步研究提供了一个理想工具。

本研究也存在一定局限性，接受 AAV8-ΔC4ATP7B 基因治疗的Atp7b^KI/KI小鼠数量有限，评估基因治疗疗效和安全性的随访时间也有限，未来还需要进一步开展动物实验研究和临床试验。

综上所述，本研究新构建的Atp7b KI 小鼠模型呈现出 WD 的铜代谢紊乱特征。在该小鼠模型中，AAV8-ΔC4ATP7B 作为一种新型治疗基因药物展现出巨大潜力，有望成为更安全、更持久的挽救铜稳态的治疗工具。