编辑推荐：
为提升 HDR 相关基因编辑效率，研究人员筛选化合物，发现 HDAC 抑制剂有效，为基因编辑提供新策略。
基因编辑技术近年来在生命科学领域掀起了一阵 “变革之风”，其中 CRISPR-Cas9 系统凭借其独特优势备受瞩目。CRISPR-Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列 / CRISPR 相关蛋白 9）最初是在细菌免疫系统中被发现，它就像细菌的 “防御卫士”，能精准识别并切割入侵病毒的特定 DNA 序列，保护细菌免受噬菌体的侵害。受此启发，科学家们将其开发成一种强大的基因编辑工具，与传统基因编辑方法相比，它操作更简便、成本更低且速度更快。
当 Cas9 对目标 DNA 进行切割，产生双链断裂（DSBs）后，细胞会启动自身的修复机制。然而，目前面临的一大难题是，在 DNA 修复过程中，非同源末端连接（NHEJ）途径占据主导地位。NHEJ 虽然能迅速修复断裂，但它就像一个 “粗心的工匠”，容易在修复过程中引入不可预测的插入或缺失（indels），导致目标基因功能被破坏，无法实现精准的基因编辑。而同源定向修复（HDR）则是一种更为精确的修复方式，它利用含有特定序列的供体 DNA，在目标位点实现精准的基因修改，就像是 “精准的裁缝”，能按照预设的 “模板” 进行修复。可惜的是，HDR 在实际应用中效率极低，在大多数情况下，超过 90% 的 DSBs 是由 NHEJ 进行修复的，这使得精确的基因编辑难以实现，严重阻碍了基因治疗等领域的发展。
为了攻克这一难题，韩国化学技术研究院（Korea Research Institute of Chemical Technology）等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于寻找能够提升 HDR 相关基因编辑效率的方法，通过一系列实验，发现了组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC inhibitors，HDACi）在其中发挥了重要作用，相关研究成果发表在《Heliyon》杂志上。
研究人员在开展研究时，用到了多种关键技术方法。在细胞实验方面，培养了 HEK293T 和 U2OS 细胞系，并进行转染和药物处理；利用细胞活力检测（CCK8 assay）评估细胞活力；通过 β - 半乳糖苷酶检测（beta-gal assay）和流式细胞术（flow cytometry）测定 HDR 效率。在分子生物学实验中，构建了多种质粒，进行了蛋白质免疫印迹（western blot）、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）和靶向深度测序（targeted deep sequencing）分析。在动物实验方面，对小鼠进行了视网膜下注射和玻璃体内注射，观察基因编辑效果。
下面来看看具体的研究结果：
- 高通量筛选药物：研究人员构建了基于光学密度检测的报告系统，以 LMNA 位点为靶点，设计了靶向其起始密码子附近的 sgRNA，并挑选出 INDEL 效率最高的 sgLMNA。同时，选择 LacZ 报告系统，构建含有 LacZ 序列的供体质粒。通过这一系统，对 2485 种来自临床化合物库的化合物进行高通量筛选。筛选时，将 Cas9、sgLMNA 和供体 DNA 质粒转染到 HEK293T 细胞中，同时加入化合物处理，最终筛选出 6 种 HDAC 抑制剂，如恩替诺特（entinostat）、伏立诺他（vorinostat）等，这些抑制剂能够显著提高 HDR 效率。
- 优化药物浓度：由于筛选实验是在统一浓度下进行的，研究人员进一步检测不同浓度 HDAC 抑制剂对细胞活力和 HDR 效率的影响。结果发现，当 HEK293T 细胞分别在 1 μM 伏立诺他、3 μM 瑞司美诺他（resminostat）、0.01 μM 帕比司他（panobinostat）、3 μM 恩替诺特、1 μM 多马司他（domatinostat）、20 μM 他西地林（tacedinaline）或 1 μM 莫西司他（mocetinostat）的浓度下培养时，细胞活力能保持在 90% 以上。在这些浓度下，瑞司美诺他、恩替诺特、他西地林和莫西司他可提高 HDR 效率，后续实验便在这些最佳浓度下进行。
- 验证 HDAC 抑制剂对 HDR 的增强作用：为解决同时转染三个质粒效率低的问题，研究人员构建了可诱导表达 Cas9 的 iCas9/HEK293T 细胞系，并将 sgRNA 和供体质粒整合到一个载体中，构建了单载体报告系统。利用这一优化系统，发现恩替诺特、他西地林和莫西司他能显著提高 HDR 效率，其中他西地林的效果尤为突出。此外，通过构建 sgLMNA-EGFP 单载体报告系统，在单细胞水平检测 HDR 效率，结果表明他西地林在促进 HDR 介导的大 DNA 片段插入方面效果最佳。
- HDAC 抑制剂对 CRISPR 系统组件表达的影响：研究人员检测了 HDAC 抑制剂处理后 DNA 修复蛋白和 CRISPR 系统组件的表达水平。结果显示，HDAC 抑制剂处理后，Rad51、Ku70 和 Ku80 等 DNA 修复蛋白的表达水平未发生改变，但大多数 HDAC 抑制剂能提高 Cas9 的蛋白水平，同时显著增加 Cas9 mRNA 和 sgLMNA 的表达水平。进一步实验表明，HDAC 抑制剂不会影响质粒的递送效率，而是增强了递送质粒的蛋白表达。
- 靶向深度测序验证：通过设计含有 3X-HA 标签序列的供体质粒进行靶向深度测序，发现恩替诺特和他西地林能增强 HDR 介导的 3X-HA DNA 插入，且在使用单链寡核苷酸（ssODNs）作为供体时，HDR 效率也显著提高。此外，HDAC 抑制剂在某些靶点可降低 INDEL 频率，且在无供体实验中，INDEL 频率也有所降低。
- 在 U2OS 细胞中的研究：在 U2OS 细胞中，研究人员确定了 HDAC 抑制剂的安全有效浓度，并构建了 iCas9/U2OS 细胞系。但与 HEK293T 细胞不同，HDAC 抑制剂在 U2OS 细胞中对 CRISPR 系统组件的表达上调作用不明显，HDR 和 NHEJ 介导的基因编辑效率也没有显著提高，这表明细胞系对 HDAC 抑制剂的反应存在差异。
- 体内实验：在小鼠体内实验中，研究人员将基因编辑组件注射到小鼠视网膜下，随后给予 HDAC 抑制剂处理。结果发现，恩替诺特处理组小鼠视网膜和视网膜色素上皮（RPE）中 mCherry 的表达增加，而他西地林组未取得统计学显著结果，这表明 HDAC 抑制剂在体内和体外的效果存在差异。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员开发了可靠且经济高效的高通量筛选系统，筛选出 HDAC 抑制剂可显著提高 HDR 效率，尤其是他西地林和恩替诺特效果突出。研究还确定了各 HDAC 抑制剂的合适处理浓度，为后续研究提供了重要参考。此外，研究揭示了 HDAC 抑制剂可能通过上调 CRISPR 系统组件的表达来增强 HDR 相关基因编辑，但具体机制还需进一步深入研究。同时，体内外实验结果的差异也提示在应用 HDAC 抑制剂进行基因编辑时，需要充分考虑不同生物系统的特点。该研究成果为基因编辑技术的发展提供了新的方向和策略，有望推动基因治疗在治疗单基因多突变相关遗传疾病方面取得新突破。
