阿司匹林响应基因开关：开启糖尿病及多种疾病治疗新征程

为解决现有小分子调控合成基因开关的临床局限性，瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员开展阿司匹林（ASA）响应基因开关研究，成功构建 ASPIRIN 系统，有望推动基于阿司匹林的联合基因疗法发展。

　　在基因治疗领域，寻找安全、精准、可持续且多功能的基因开关一直是科研人员的重要目标。目前，小分子调控的合成基因开关面临着诸多难题。经典的 TetOn/Tet-Off 系统虽广泛应用，但依赖四环素类似物，随着临床抗生素耐药问题日益严重，其应用受到限制。其他已报道的小分子驱动基因开关，像蛋白酶抑制剂、食品相关化合物等，存在细胞毒性、脱靶效应、耐药性、代谢紊乱、长期副作用、复杂的药效学和低生物利用度等问题，严重阻碍了它们在临床的广泛应用。

阿司匹林（aspirin），作为一种全球广泛使用且历史悠久的药物，具有解热、镇痛、抗炎、抗血小板等多种功效，还能降低心血管疾病风险，在预防结直肠癌、抑制肿瘤生长等方面也展现出潜力。鉴于其安全性和多面性，将阿司匹林整合到基因开关平台，被认为可能是生物医学研究的一项重大突破。

基于此，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）等机构的研究人员 Jinbo Huang、Ana Palma Teixeira、Ting Gao 等开展了相关研究，致力于开发一种由阿司匹林响应的基因开关系统，以调节治疗性蛋白的表达，为细胞联合治疗提供新途径。研究成果发表于Nature Communications。

研究人员开展此项研究运用了多种关键技术方法。在蛋白质工程与筛选方面，通过结构预测平台分析 NPR1 和 NPR4 蛋白结构，设计截短变体并进行组合测试，还利用易错 PCR 对其进行随机诱变，经多轮高通量筛选获得高灵敏度的突变体。细胞实验技术上，使用多种哺乳动物细胞系，如人胚胎肾细胞（HEK-293T）等进行转染实验，检测基因表达水平、细胞活力等指标；构建稳定细胞系时，借助 Sleeping Beauty 转座酶系统将 ASPIRIN 系统整合到 HEK-293T 细胞基因组。动物实验中，利用链脲佐菌素（STZ）诱导雄性 C57BL/6 J 小鼠建立 1 型糖尿病（T1D）模型，将微囊化的工程细胞植入小鼠体内，通过检测血糖、胰岛素水平以及炎症生物标志物评估治疗效果。

下面来看看具体的研究结果：

• 设计并表征 ASA 诱导的基因开关：研究人员起初探索了多种细菌来源的调节因子，均无法实现 ASA 依赖的转基因表达。转而聚焦植物中的 NPR1 和 NPR4 蛋白，构建了基于这两种蛋白的 ON 型系统。经结构分析和截短变体测试，筛选出 T2 截短体（NPR1-T2 和 NPR4-T2），其在 ASA 和 SA 存在时诱导倍数高达 3.8 倍。对比不同反式激活结构域，发现 VP16 能使荧光素酶（NLuc）报告基因表达诱导倍数最高。优化基因开关三个组件的质量比后，确定 4:1:4 时 NLuc 表达诱导倍数最高（ASA 诱导达 12.7 倍）。
• 基因开关的定向进化：为增强遗传回路对 ASA 或 SA 的响应性，研究人员对 NPR1-T2 和 NPR4-T2 进行多轮易错 PCR 随机诱变和高通量筛选，最终获得一对对 ASA 高度敏感的变体。NPR4 变体（NPR4-T2_mut：NPR4-T2^{N391T/K476R/T480N/A484I/R493K}）和 NPR1 变体（NPR1-T2_mut6：NPR1^{T2G391S/L427H/Q543R}）使 NLuc 诱导倍数从 12 倍提升至 44 倍。荧光显微镜、共免疫沉淀和蛋白质免疫印迹分析验证了 ASPIRIN 系统的功能，即 ASA 或 SA 可诱导复合物解离，调节转基因表达。
• ASPIRIN 系统的表征与验证：剂量响应曲线显示，在 10 μM 至 250 μM 范围内，ASA 或 SA 浓度与报告基因表达呈近似线性关系，EC₅₀值分别为 70.5 μM 和 46.4 μM，且该浓度范围内对细胞活力无显著影响。该系统在多种哺乳动物细胞系中均能发挥功能，基于诱导倍数、基础和最大表达水平，选择 HEK-293T 细胞进行后续实验。实验还证明该系统具有良好的可逆性，对香草酸（VA）也有响应，VA 可作为额外调节机制和安全保障。
• ASPIRIN 单克隆细胞系的生成与表征：研究人员以 T1D 为研究对象，构建了稳定表达 ASPIRIN 系统的单克隆细胞系 HEK-ASPIRIN，其中胰岛素（mINS）作为治疗性蛋白。筛选出的 HEK-ASPIRIN 细胞系诱导倍数高、基础表达低，FACS 分析证实其携带相关荧光标记构建体，细胞胰岛素活性实验验证了表达胰岛素的生理活性。该细胞系对 ASA 和 SA 的响应 EC₅₀值与瞬时转染的 HEK-293T 细胞相似，且胰岛素释放具有剂量和时间依赖性，对 VA 也有响应。
• ASPIRIN 系统的特异性和正交性：测试多种 ASA 类似物，发现多数无法诱导 HEK-ASPIRIN 细胞系的 NLuc 表达，仅水杨酸甲酯（MSC）有微弱活性。研究 ASA 代谢产物对系统的影响时发现，2,3 - 二羟基苯甲酸（2,3DHBA）和 SA 酰基 -β-D - 葡萄糖醛酸（SAADG）能有效诱导系统，这表明体内 ASA 代谢产物可维持 ASPIRIN 系统的激活，延长治疗蛋白表达时间。
• 阿司匹林诱导胰岛素表达治疗 T1D：将 HEK-ASPIRIN 细胞微囊化后植入 T1D 小鼠体内，给予 ASA 或 SA 后，小鼠空腹血糖显著降低至正常水平，循环胰岛素显著增加，VA 可逆转这些变化。葡萄糖耐量试验证实治疗组小鼠血糖稳态恢复，餐后血糖波动减轻。治疗组小鼠在四周研究中维持正常血糖水平，每周胰岛素检测显示血液胰岛素显著增加。
• ASA 减轻糖尿病神经病变和慢性炎症相关生物标志物：通过三种疼痛行为测试证实 ASA 具有镇痛作用。在 T1D 小鼠糖尿病神经病变模型中，植入微囊化 HEK-ASPIRIN 细胞并给予 ASA 治疗，不仅改善血糖，还使疼痛感知相关生物标志物和糖尿病并发症相关生物标志物恢复正常，降低慢性炎症生物标志物水平。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功开发了一种敏感、可逆且可调的转基因平台 ASPIRIN，可在哺乳动物细胞中响应 ASA 表达治疗性蛋白。利用植物来源的 SA 传感器 NPR1 和 NPR4，经筛选和进化获得高灵敏度的 ASA 传感器。ASPIRIN 系统特异性强，仅对 ASA 及其少数代谢产物有响应，延长了体内治疗蛋白表达和治疗效果。该系统具有良好的特异性、可逆性和生物相容性，结合了阿司匹林的治疗优势和基因 / 细胞治疗，为多种疾病治疗带来新希望，如心脏病、中风、结直肠癌和神经退行性疾病等，有望推动基于阿司匹林的联合基因疗法发展。不过，虽然 ASPIRIN 系统展现出诸多优势，但未来仍需进一步研究其长期安全性和有效性，以及在更广泛疾病模型中的应用潜力。