利用纯化的末端酶和大肠杆菌整合宿主因子对噬菌体 λ DNA 包装的单分子测量：开启病毒包装机制研究新篇

为解决噬菌体 λ DNA 包装研究中体系复杂及粗提物干扰问题，研究人员构建最小体系，发现 IHF 作用，成果利于深入探究包装机制。

　　在微观的病毒世界里，许多双链 DNA（dsDNA）病毒在组装过程中，会借助 ATP 驱动的分子马达将其基因组包装进病毒衣壳，这一过程对病毒的生存和繁衍至关重要。噬菌体 λ 作为研究病毒 DNA 包装的重要模型，其包装机制却较为复杂。以往的研究使用大肠杆菌粗细胞提取物来检测包装事件，虽然能发现包装活动，但粗提物中众多成分会干扰对包装过程的精确研究，阻碍了人们对噬菌体 λ DNA 包装分子机制的深入理解。比如，粗提物中的多种宿主细胞蛋白和生物分子，可能会以未知的方式影响包装反应，使研究人员难以确定真正影响包装的关键因素。为了突破这些困境，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校物理系以及科罗拉多大学丹佛分校斯卡格斯药学院和制药科学系的研究人员 Brandon Rawson、Qin Yang、Carlos E. Catalano 和 Douglas E. Smith 展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为噬菌体 λ DNA 包装机制的研究开辟了新道路。

研究人员开展这项研究的核心目的是构建一个简单、明确的实验体系，用于精确研究噬菌体 λ DNA 的包装过程，解析关键蛋白在其中的作用。为此，他们采用了一系列关键技术方法。首先是光学镊子技术（optical tweezers），这一技术就像是微观世界的 “镊子”，能够实时测量单个 DNA 分子包装进单个病毒衣壳的过程。其次，研究人员对实验所需的各种成分进行了纯化，包括噬菌体 λ 末端酶全酶（terminase holoenzyme）、整合宿主因子（integration host factor，IHF）、噬菌体 λ 原衣壳（procapsids）等。通过这些纯化步骤，排除了粗提物中杂质的干扰，让研究体系更加纯净、可控。

研究结果主要有以下几方面：

1. 单分子检测体系的建立：研究人员利用高度纯化的噬菌体 λ 末端酶全酶开展光学镊子实验。结果显示，在添加纯化的大肠杆菌 IHF 后，包装检测效率与使用粗细胞提取物时相当。例如，“Pure 1 + IHF” 和 “Pure 2 + IHF” 末端酶样品的包装检测效率分别达到了 43% 和 40%，与使用粗提物时的 38% 相近。这表明，仅使用纯化的噬菌体 λ 原衣壳、末端酶、IHF 和 ATP，就能有效重现单分子包装活性，成功建立了最小化的研究体系。
2. IHF 对包装的影响：实验发现，在光学镊子实验中，IHF 是检测包装事件的关键。没有 IHF 时，即便等待更长时间，也无法检测到包装事件。而且，缺乏 IHF 时，末端酶倾向于非特异性地结合 DNA，而非特异地结合到包装起始位点 cos 序列。这说明 IHF 在引导末端酶特异性结合 cos 位点、启动包装过程中起着不可或缺的作用。
3. 包装动力学和运动力分析：对比使用粗末端酶提取物和纯化末端酶样品（添加 IHF）的光学镊子测量结果，研究人员发现，多个衡量运动功能的指标，如平均运动速度、暂停频率、暂停持续时间以及产生的最大力等，在两种情况下没有显著差异。这意味着除了 IHF，大肠杆菌提取物中的其他成分对包装马达的功能影响不大，以往使用粗提物的研究可能并未受到其他杂质的显著干扰。
4. 核苷酸非依赖的运动蛋白 - DNA 相互作用：研究人员运用新开发的方法研究无 ATP 时运动蛋白与 DNA 的相互作用。结果显示，使用粗末端酶提取物和纯化末端酶样品（添加 IHF）组装的运动复合体，在多个相关指标上没有显著差异。例如，平均瞬时滑动速度在不同样品间差异很小，这表明在核苷酸非依赖的情况下，粗提物和纯化体系中运动蛋白与 DNA 的相互作用相似。

在研究结论和讨论部分，该研究成果意义重大。一方面，研究人员成功开发了利用光学镊子和纯化成分高效测量噬菌体 λ DNA 包装的方法，构建的最小化体系为后续研究其他噬菌体蛋白对包装动力学的影响提供了理想平台。借助这个平台，研究人员可以更精准地研究如 gpFI、gpW、gpFII 等蛋白在包装过程中的作用。另一方面，研究明确了 IHF 在噬菌体 λ DNA 包装中的关键作用，证实了除 IHF 外，粗提物中的其他成分对包装马达功能影响较小。这不仅加深了人们对噬菌体 λ DNA 包装机制的理解，也为未来研究其他病毒的包装机制提供了重要参考，有助于推动整个病毒学领域对病毒装配过程的认知，为抗病毒药物研发、新型病毒防治策略的制定等提供理论基础 。