CAND2 调控 SCF 泛素连接酶的分子机制：解锁细胞蛋白降解的神秘 “钥匙”

为探究 CAND2 在人体细胞中的作用及作用机制，美国普渡大学的研究人员研究 CAND2 对 SCF 组装和活性的影响，发现 CAND2 可促进 SCF 介导的蛋白降解，但其调控 SCF 的动力学参数和生化效应与 CAND1 不同，为理解 CAND2 在健康和疾病细胞中的作用奠定基础。

　　在细胞的微观世界里，蛋白质的合成与降解如同一场精密的 “舞蹈”，维持着细胞的正常运转。其中，由 SKP1?CUL1?F-box 蛋白（SCF）泛素连接酶所调控的蛋白质降解过程，更是这场 “舞蹈” 中至关重要的环节。它就像细胞内的 “质量控制员”，及时清除那些不再需要或出现异常的蛋白质，确保细胞和生物体的功能正常。而 CAND1 作为这场 “舞蹈” 的 “编舞师” 之一，通过促进 SCF 的动态组装，使得不同的 SCF 靶蛋白能够适时地被泛素化修饰，进而被降解。然而，与 CAND1 有着 63% 序列同一性的 CAND2，虽然已被发现与多种人类疾病相关，可它在这场 “舞蹈” 中的角色和作用机制却一直是个谜。为了揭开这个谜团，深入了解细胞内蛋白质降解的调控机制，来自美国普渡大学（Purdue University）的研究人员展开了一系列深入研究。
研究人员综合运用生化、生物物理和细胞生物学等多种技术手段，对 CAND2 在人体细胞中的作用及其独特的作用模式进行了全面探究。最终发现，CAND2 作为 F-box 蛋白交换因子，能够促进 SCF 介导的蛋白质降解，但其在调控 SCF 时的动力学参数和生化效应与 CAND1 存在差异。这一研究成果不仅为深入理解 CAND2 在细胞内的功能提供了关键线索，也为后续探究其在健康细胞和疾病细胞中的作用机制奠定了坚实基础，发表于Nature Communications。
在这项研究中，研究人员运用了多种先进的技术方法。在细胞实验方面，构建并使用了多种细胞系，如 CAND1/CAND2 单敲除（KO）或双敲除（DKO）的 HEK293 细胞、CAND2-KO 的 JMSU-1 细胞等，通过基因编辑技术精确改变细胞内 CAND2 的表达水平。同时，利用免疫沉淀（IP）、免疫印迹（western blot）技术检测蛋白质之间的相互作用和表达水平变化；借助蛋白质组学技术，如稳定同位素标记氨基酸的细胞培养（SILAC）结合质谱分析，大规模研究蛋白质的变化情况。在结构研究方面，采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析 CUL1?CAND2 复合物的结构，获得其高分辨率的三维结构信息。
下面来看具体的研究结果：

• CAND2 与 CUL1 结合并促进 SCF 依赖的蛋白质降解：通过体外 pulldown 实验和共免疫沉淀（co-IP）实验，研究人员发现 CAND2 能直接结合 CUL1，且更倾向于结合未被 NEDD8 修饰的 CUL1。进一步研究发现，在肿瘤坏死因子 α（TNF-α）存在的情况下，CAND2 可恢复 CAND1/CAND2 双敲除（DKO）细胞中磷酸化 IκBα（p-IκBα）的降解，表明 CAND2 能够促进 SCF 活性。同时，在铁诱导的 IRP2 降解实验中，敲除 CAND2 会导致 IRP2 降解速率降低，且 IRP2 与活性 SCF^FBXL5复合物的结合效率下降，这一系列实验证明了 CAND2 能够促进 SCF 介导的蛋白质降解。
• CAND2 对 SCF 组装和蛋白质周转的广泛影响：研究人员利用质谱分析技术，对表达内源性 3xFLAG CUL1 的 HEK293 细胞进行研究，发现敲除 CAND2 会改变多种 SCF 的组装水平。在 JMSU-1 膀胱癌细胞系中，敲除 CAND2 同样会损害铁诱导的 IRP2 降解，并且通过动态 SILAC 实验发现，敲除 CAND2 会影响大量蛋白质的周转速率，其中部分蛋白质是 SCF 的靶蛋白或潜在靶蛋白，这揭示了 CAND2 对细胞内蛋白质周转的广泛影响，且这种影响部分是通过改变 SCF 活性实现的。
• CAND2 促进多种 F-box 蛋白的动态交换：体外 pulldown 实验和细胞内实验表明，CAND2 能够促进 F-box 蛋白（FBPs）的交换，加速 SCF 的解聚和新 SCF 的组装。SILAC-based 蛋白质组学方法研究发现，尽管 CAND2 能够促进多种 FBPs 的动态交换，但与 CAND1 相比，其效率较低。此外，不同 FBPs 的交换水平存在差异，这可能与 SCF 复合物的结构多样性或 F-box 序列的变化有关。
• SCF 复合物的差异解离动力学：通过 SILAC-based 蛋白质组学分析 SCF 复合物的解离动力学，研究人员发现不同 FBPs 从 CUL1 上解离的速率（koff）存在差异，且 FBPs 的交换水平与解离水平存在相关性。例如，FBXL8 和 FBXO33 在 DKO 细胞中具有较高的交换水平和较高的解离水平，而 FBXO7 和 FBXO9 则表现出较低的交换和解离水平。
• CAND1 和 CAND2 与 CUL1 结合的结构和亲和力比较：单颗粒冷冻电镜成像显示，CUL1?CAND2 复合物的整体结构与 CUL1?CAND1 复合物相似，CAND2 的 β 发夹结构与 CUL1 的第一个 cullin 重复区域相互作用，且与 SKP1 存在结构冲突，这为 CAND2 介导的 FBPs 交换提供了类似的分子基础。FRET-based 动力学实验表明，CAND2 与 CUL1 形成的复合物稳定性较高，其与 CUL1 的结合亲和力与 CAND1 相近，但解离常数（KD）略有差异。
• SKP1?SKP2 对 CUL1?CAND2 组装和解聚的影响：利用新建立的 CUL1?CAND FRET 实验，研究人员发现 SKP1?SKP2 能够加速 CUL1?CAND2 复合物的解离，且 CAND2 从 CAND2?CUL1?SKP1?SKP2 中间复合物中解离的速率比从 CAND2?CUL1 复合物中解离的速率快得多。
• CAND2 与 CAND1 加速 SCF 解聚的效率比较：新建立的 FRET 实验表明，CAND1 和 CAND2 对 SCF^SKP2组装的影响较小，但在加速 SCF 解聚方面，CAND2 的效率低于 CAND1。虽然两者使 SCF 解聚的最大速率相近，但 CAND2 催化 SCF 解聚的 KM 值比 CAND1 高约 14 倍，这表明 CAND2 在解聚 SCF 时效率较低。

研究结论和讨论部分，研究人员揭示了 CAND2 在调控 SCF 泛素连接酶方面的重要作用，明确了它作为 F-box 蛋白交换因子促进 SCF 介导的蛋白质降解的功能，同时阐述了其与 CAND1 在调控 SCF 时的异同点。然而，仍有一些问题有待进一步研究。例如，CAND2 在细胞内如何通过较低的交换活性实现与 CAND1 相似的促进蛋白质降解的效果，细胞从拥有 CAND2 这个较弱的交换因子中获得了哪些益处，以及为什么不同细胞类型对 CAND1 和 CAND2 的需求存在差异等。这些问题的深入研究将有助于更全面地理解细胞内蛋白质降解的调控网络，为相关疾病的治疗和干预提供新的理论依据和潜在靶点。
总的来说，这项研究成果为深入理解 CAND2 在细胞内的功能和作用机制提供了重要依据，为后续探究其在健康和疾病细胞中的作用奠定了坚实基础，有望为相关疾病的研究和治疗开辟新的方向。