《BMC Genomics》CRISPR 新突破：构建最小全基因组文库，提升筛选效能

为解决全基因组 CRISPR sgRNA 文库因大尺寸受限问题，研究人员开展对相关文库的评估及新文库设计研究，发现小文库性能优异，为相关研究带来成本和效率优势。

　　

在生命科学的研究领域，CRISPR-Cas9 基因编辑技术就像一把神奇的 “基因剪刀”，为探索基因功能提供了强大的工具。全基因组 CRISPR sgRNA（single guide RNA，引导 RNA）文库能够系统性地探究基因功能，在生物医学研究中发挥着重要作用。然而，随着研究的深入，这些文库的局限性也逐渐显现出来。虽然经过不断优化，它们在减少脱靶效应和提高靶向效率方面取得了进展，但文库尺寸过大的问题却限制了其在一些应用中的使用，比如在类器官研究和体内实验中，不仅成本高昂，操作也极为不便。

为了突破这一瓶颈，研究人员踏上了探索之旅，开展了一项极具意义的研究。他们旨在评估现有公开的全基因组单靶向 sgRNA 文库，并探索双靶向作为混合 CRISPR 功能缺失筛选策略的可行性，进而设计出更小且性能优异的全基因组 CRISPR-Cas9 文库。最终，他们成功设计出两个最小全基因组人类 CRISPR-Cas9 文库，比其他文库小 50%，同时还保留了特异性和敏感性。这一成果意义非凡，它为相关研究带来了成本和效率的显著提升，让在更多场景下大规模开展基因功能研究成为可能。该研究成果发表在BMC Genomics期刊上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。首先，通过构建不同的 CRISPR-Cas9 文库，包括基准文库、维也纳（Vienna）文库等，实现对不同基因的靶向。接着，使用多种细胞系进行实验，如 HCT116、HT-29 等结肠癌细胞系以及 HCC827、PC9 等肺癌腺癌细胞系。然后，借助慢病毒转导技术将文库导入细胞，实现基因编辑。在分析环节，利用下一代测序（NGS）技术对基因编辑后的细胞进行检测，并运用 CRISPRcleanR、Chronos、MAGeCK 等算法对测序数据进行处理和分析。

结果与讨论

1. 不同文库性能评估：常用 CRISPR 文库间 sgRNA 重叠度较低，难以判断哪个文库在功能缺失筛选中表现最佳。研究人员构建了一个基准人类 CRISPR-Cas9 文库，包含来自 6 个现有文库针对特定基因的 gRNA 序列。通过在多种结肠癌细胞系中进行必需性筛选发现，基于 VBC（Vienna Bioactivity CRISPR）评分选出的 top3-VBC guides 表现出最强的消耗曲线，bottom3-VBC guides 表现最弱，Yusa 和 Croatan 文库表现较好。Chronos 算法分析显示，top3-VBC 文库中每个基因 3 个 guides 的性能不逊色于其他含更多 guides 的文库，且 VBC 评分与靶向必需基因的 guides 的 log-fold changes 呈负相关，可用于预测 gRNA 的功效。

2. 双靶向策略评估：为比较单靶向和双靶向策略，研究人员构建了 “benchmark-dual human CRISPR-Cas9 library”。在多个细胞系中进行致死性筛选后发现，双靶向 guide pairs 对必需基因的消耗平均比单靶向更强，但对非必需基因的富集较弱。这可能是由于双靶向在基因组中产生更多双链 DNA（dsDNA）切割，带来潜在的 DNA 损伤反应，影响了筛选结果。此外，研究还发现 gRNA 对之间的距离对筛选结果无明显影响。

3. 小文库性能测试：研究人员使用由每个基因的前 3 个 VBC guides 组成的 Vienna-single 文库和 Yusa v3 6-guide 文库，在肺癌腺癌细胞系中进行奥希替尼（Osimertinib）药物 - 基因相互作用抗性筛选，同时使用 Vienna-dual 双靶向文库进行对比。结果显示，在验证的抗性基因中，Vienna-single 和 Vienna-dual 文库表现出最强的抗性 log fold changes，Yusa 文库表现最差。综合来看，Vienna-dual 文库在两个细胞系中的效应量始终最高。

研究结论与意义

本研究表明，根据合理标准选择 guides 的较小文库在致死性和药物 - 基因相互作用筛选中的性能与较大文库相当甚至更优。这一发现为基因功能研究领域带来了新的曙光，较小的文库不仅能降低试剂和测序成本，还能提高通量，使在材料有限的应用中开展研究变得更加可行。同时，双靶向文库虽然存在潜在的 DNA 损伤反应问题，但在筛选性能上有一定优势，为 CRISPR 文库的进一步压缩提供了有前景的方向。不过，在使用双靶向文库时需要谨慎考虑其适用场景。总体而言，该研究成果为 CRISPR 技术在基因功能研究、药物研发等领域的广泛应用奠定了更坚实的基础，推动了生命科学和健康医学领域的发展。