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本文揭示塞内卡谷病毒（SVV）蛋白酶 3C 通过切割核 cGAS 和组蛋白 H2A 逃避免疫，为抗病毒研究提供新思路。
引言
环状 GMP - AMP 合成酶（cGAS）在机体免疫防御中扮演着关键角色，它能够识别错位的基因组、线粒体以及微生物双链 DNA（dsDNA） 。一旦识别，cGAS 就会被激活，进而合成环状二核苷酸 2′3′ - cGAMP。cGAMP 作为第二信使，通过刺激干扰素基因（STING）及下游信号通路，诱导 Ⅰ 型干扰素（IFN - Ⅰ）的表达，从而启动机体的先天免疫反应。
cGAS 由带正电荷的无序 N 端结构域和 C 端催化结构域组成。近年来，N 端结构域的功能备受关注，它在促进 cGAS 与 DNA 的液相凝聚、与磷脂酰肌醇 4,5 - 二磷酸（PI (4,5) P2）相互作用以实现膜定位，以及在有丝分裂期间被磷酸化防止 cGAS 被染色质激活等方面都发挥着重要作用。
研究发现，cGAS 在细胞质和细胞核中均有分布，且主要集中在细胞核。在细胞核内，cGAS 与组蛋白 H2A 和 H2B 的酸性区域紧密结合，这一结合模式阻断了 cGAS 的 DNA 结合位点 B，使其处于失活状态。然而，在某些特定情况下，如 DNA 损伤时，核 cGAS 会被招募到双链断裂处，参与调控 DNA 修复过程，不过这一过程有时会促进肿瘤的发生。此外，核 cGAS 还在稳定复制叉、维持基因组完整性方面发挥着重要作用。值得注意的是，核 cGAS 在特定条件下也能催化 cGAMP 的合成，引发先天免疫激活。
病毒为了逃避 cGAS 的识别，进化出了多种策略，包括通过自噬依赖的降解途径、稳定 caspase - 1 来切割 cGAS、与 dsDNA 竞争结合以及直接切割 cGAS 等。但目前针对病毒如何靶向核 cGAS 的研究还相对较少。
塞内卡谷病毒（SVV）属于小核糖核酸病毒科，是一种非包膜、单链、正链 RNA 病毒，具有溶瘤特性，在肿瘤治疗方面展现出一定的潜力。SVV 的 3C 蛋白酶在病毒多肽加工和逃避宿主免疫方面起着关键作用。已有研究表明，SVV 3C 能特异性切割猪 cGAS（pcGAS），抑制线粒体 DNA 介导的先天免疫感应。此外，小核糖核酸病毒科的其他病毒，如脊髓灰质炎病毒（PV）、人鼻病毒（HRV）、脑心肌炎病毒（EMCV）、肠道病毒 71 型（EV - A71）等的 3C 蛋白酶也有进入细胞核的报道，但它们在细胞核内的具体功能，尤其是与 SVV 3C 蛋白酶功能的相似性，仍有待深入探究。
结果
SVV 感染诱导蛋白酶 3C 向细胞核转位并导致核 DNA 泄漏
许多 RNA 病毒感染会引发线粒体 DNA 泄漏，近期研究发现诺如病毒感染还会导致核 DNA 泄漏到细胞质中。基于此，研究人员探究了 SVV 感染是否也会引发类似现象。通过对多种细胞（如人胚肾 HEK - 293T 细胞、猪肾 PK - 15 细胞和猪睾丸 ST 细胞）进行 SVV 感染实验，利用 RT - qPCR 检测细胞质中泄漏的核 DNA 水平，结果显示感染后核 DNA 水平显著升高，这表明 SVV 感染会导致人和猪细胞中广泛的核 DNA 泄漏。
进一步研究发现，SVV 的 3C 蛋白酶而非 2C 蛋白酶能够转位到细胞核，这一结论通过共聚焦显微镜和蛋白质免疫印迹分析得到了证实。通过构建 3C 蛋白酶的 N 端截断突变体，研究人员发现 3C 蛋白酶的 N 端 1 - 20 个氨基酸残基是其核转位的关键区域。此外，研究还发现其他小核糖核酸病毒（如 EV - A71、EMCV、CVB3、PV 和 HRV）的 3C 蛋白酶在转染后也能转位到细胞核。
SVV 蛋白酶 3C 特异性切割 H2A
核小体在染色体稳定性、基因表达调控、DNA 复制和修复等过程中起着至关重要的作用，其核心蛋白包括组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4。鉴于 FMDV 的 3C 蛋白酶能够切割 H3，研究人员推测 SVV 3C 蛋白酶可能也会切割组蛋白。实验结果显示，在 HEK - 293T 细胞中转染 SVV 3C 质粒后，H2A 的表达显著降低，而 H2B、H3 和 H4 的表达不受影响。体外实验也证实了 SVV 3C 蛋白酶能够特异性切割 H2A，且该切割作用依赖于 3C 蛋白酶的酶活性。通过质谱分析，进一步确认了 H2A 被 3C 蛋白酶切割的事实。此外，研究还发现 SVV 感染或 3C 质粒转染后，ST 和 HEK - 293T 细胞内源性 H2A 的蛋白水平显著降低，且 3C 蛋白酶还会影响参与 DNA 复制、转录、修复和核小体稳定性维持的核蛋白。
SVV 蛋白酶 3C 与核小体 DNA 结合
核小体是染色质的基本结构单位，由 147 个碱基对的 DNA 缠绕在核心组蛋白八聚体上组成。为了探究 3C 蛋白酶与核小体的相互作用，研究人员进行了一系列实验。通过 Native gel 电泳和酶切实验发现，3C 蛋白酶能够与核小体结合，并保护核小体免受酶切，这表明 3C 蛋白酶可能与连接 DNA 相互作用。电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，SVV 和 EMCV 的 3C 蛋白酶能够与核小体 DNA 结合，且 SVV 3C 蛋白酶的结合能力更强，而 EV - A71 的 3C 蛋白酶则不与核小体 DNA 结合。等温滴定量热法（ITC）测定结果表明，SVV 3C 蛋白酶与干扰素刺激 DNA（ISD45）的结合亲和力约为 5 μM。通过 HADDOCK2.4 模拟和突变体验证，确定了 SVV 3C 蛋白酶与 DNA 结合的关键位点。此外，通过染色质免疫沉淀 qPCR（ChIP - qPCR）实验，在细胞内也证实了 SVV 3C 蛋白酶与核 DNA 的结合。
SVV 3C 与核 cGAS 共定位并切割其 N 端结构域
为了探究 3C 蛋白酶与 pcGAS 在细胞核内的关系，研究人员构建了稳定表达 GFP - pcGAS - HA 的 HeLa 细胞系。共聚焦显微镜观察发现，在转染 Flag - 3C 质粒或感染 SVV 后，3C 蛋白酶与 pcGAS 在细胞核内共定位。进一步研究表明，SVV 感染或转染野生型 3C 质粒后，核 pcGAS 会被切割，且切割依赖于 3C 蛋白酶的酶活性。在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中感染 SVV 后，也观察到核内 pcGAS 的内源性水平显著降低。
双链 DNA 显著增强 SVV 3C 的切割活性
考虑到 cGAS 与核小体的结合模式，研究人员推测核小体 DNA 与 3C 蛋白酶的结合可能会影响其对核 pcGAS 的切割作用。在体外实验中，向含有 SVV 3C 和 pcGAS 重组蛋白的细胞无细胞体系中加入不同剂量的 ISD45、ISD90 或核小体 DNA，结果发现 3C 蛋白酶对 pcGAS 的切割作用增强。同样，在含有 H2A 重组蛋白的体系中加入 ISD45，也能增强 3C 蛋白酶对 H2A 的切割。而当使用 DNA 结合能力受损的 3C 突变体（R111A/K198A/K201A）时，ISD45 则不再促进 pcGAS 的切割。这表明 dsDNA 与 3C 蛋白酶的结合能够增强其切割活性。
SVV 3C 切割核 cGAS 的 N 端以逃避免疫限制
以往研究表明，核 cGAS 在 DNA 刺激下会转位到细胞质中。为了研究 SVV 感染对 pcGAS 转位的影响，研究人员构建了稳定表达全长或 C 端 pcGAS 的 ST 细胞系。免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示，在 poly (dA:dT) 刺激下，未感染 SVV 的细胞中 pcGAS 会转位到细胞质，但感染 SVV 后，pcGAS 主要滞留在细胞核内。进一步研究发现，缺失 N 端结构域的 pcGAS 在刺激下无法转位到细胞质，且 IFN - β 的表达显著降低。此外，表达野生型 3C 蛋白酶的细胞在 poly (dA:dT) 刺激后，IFN - β 的 mRNA 水平和 IFN - α 的分泌量均显著降低，而表达无酶活性 3C 突变体的细胞则无此现象。这表明 SVV 蛋白酶 3C 通过切割核 pcGAS 的 N 端，抑制其转位到细胞质，从而抑制 IFN - Ⅰ 的产生，实现免疫逃避。
讨论
免疫系统在抵御病原体入侵、维持细胞内环境稳定方面发挥着重要作用。线粒体和细胞核是细胞生存、生长和分裂的关键细胞器。病毒感染导致线粒体 DNA 泄漏的现象较为常见，但核 DNA 泄漏的报道相对较少。SVV 感染会导致核 DNA 泄漏，且 SVV 3C 蛋白酶在其中起到了关键作用，它不仅转位到细胞核，还能切割组蛋白 H2A，破坏核小体功能，这可能是核 DNA 泄漏的重要原因。虽然已有研究表明多种小核糖核酸病毒的 3C 蛋白酶能够转位到细胞核，但其具体功能是否与 SVV 3C 蛋白酶相似，仍需进一步研究。
cGAS 最初被认为主要存在于细胞质中，是 dsDNA 的重要传感器，在 IFN - Ⅰ 的诱导过程中发挥关键作用。然而，越来越多的证据表明，cGAS 主要位于细胞核内。为了逃避 cGAS 介导的免疫识别，病毒进化出了多种策略，但此前尚未有针对核 cGAS 的病毒策略报道。本研究首次发现 SVV 蛋白酶 3C 能够切割核 cGAS 的 N 端结构域，且双链 DNA 能够增强这一切割作用。这一现象可能是由于 3C 蛋白酶与 DNA 结合后发生了构象变化，或者是底物与 DNA 相互作用产生的邻近效应所致。
核 cGAS 的 B 位点与核小体相互作用，抑制 cGAS 的活性，这对于维持基因组稳定性至关重要。同时，核 cGAS 在抗病毒防御中也发挥着重要作用。正常情况下，核 cGAS 在刺激下会转位到细胞质中，其 N 端结构域对于细胞质定位至关重要，而细胞质定位是 cGAS 检测细胞质 DNA 并触发 IFN 反应的关键步骤。SVV 3C 蛋白酶转位到细胞核后，切割核 cGAS 的 N 端，阻止其转位到细胞质，从而逃避免疫限制。尽管细胞质中泄漏的 DNA 可能会激活 cGAS，但核 cGAS 转位受阻可能导致其无法有效识别 DNA，这一现象仍需进一步深入研究。
材料和方法
研究过程中使用了多种细胞系，包括 HEK - 293T 细胞、ST 细胞、PK - 15 细胞、PAMs 和 HeLa 细胞等，这些细胞在含有 10% 胎牛血清的培养基中培养。同时，实验用到了 SVV 和 EMCV 等病毒。
在实验中，使用了多种抗体来检测相关蛋白，如抗组蛋白 H3、抗 Myc、抗 HA、抗 DNA、抗 Flag 等抗体。此外，还构建了多种质粒，包括 SVV、EV - A71、EMCV 等病毒的 3C 质粒，以及带有不同标签的 cGAS、组蛋白质粒和 3C 蛋白酶突变体质粒等。
为了研究蛋白的功能，对相关蛋白进行了表达和纯化，包括 SVV 3C、EV - A71 3C、EMCV 3C 以及猪组蛋白 H2A、H2B、H3、H4 等。通过一系列实验技术，如检测核 pcGAS 的切割、体外切割实验和质谱分析、检测细胞质中的核 DNA、免疫荧光、核小体提取和酶切、电泳迁移率变动分析、等温滴定量热法、蛋白质 - DNA 结构建模、细胞核和细胞质提取、稳定表达细胞系构建、染色质免疫沉淀 qPCR、qRT - PCR 和酶联免疫吸附测定等，对病毒感染过程中的各种现象和机制进行了深入研究。在数据分析方面，使用 GraphPad Prism version 8.0.1 软件进行统计分析，以 P < 0.05 为具有统计学意义。
研究总结
本研究深入揭示了塞内卡谷病毒（SVV）的 3C 蛋白酶在感染过程中的一系列作用机制。SVV 感染会导致核 DNA 泄漏，而 3C 蛋白酶在这一过程中扮演着关键角色。它不仅能够从细胞质转位到细胞核，还能特异性地切割组蛋白 H2A，破坏核小体的正常功能。同时，3C 蛋白酶与核小体 DNA 具有较强的结合能力，这一结合进一步增强了其对核 cGAS 的切割作用。通过切割核 cGAS 的 N 端结构域，3C 蛋白酶阻碍了 cGAS 从细胞核转位到细胞质，从而抑制了 Ⅰ 型干扰素（IFN - Ⅰ）的诱导产生，帮助病毒实现免疫逃避。
这些研究结果为理解病毒与宿主免疫系统的相互作用提供了新的视角，也为开发针对 SVV 感染以及其他相关病毒感染的治疗策略提供了潜在的靶点。未来的研究可以进一步深入探究 3C 蛋白酶与其他宿主蛋白的相互作用，以及这些相互作用在病毒感染进程中的动态变化。此外，针对 3C 蛋白酶的功能开发特异性抑制剂，有望为抗病毒治疗开辟新的途径，这对于保障人类和动物的健康具有重要的意义。
