非洲猪瘟病毒关键毒力基因 MGF_360-4L 的探秘之旅：免疫逃逸机制与疫苗新希望

《mBio》：The African swine fever virus gene MGF_360-4L inhibits interferon signaling by recruiting mitochondrial selective autophagy receptor SQSTM1 degrading MDA5 antagonizing innate immune responses

本文揭示非洲猪瘟病毒（ASFV）MGF_360-4L 基因免疫逃逸机制，为 ASFV 疫苗开发提供新方向。

　　# 非洲猪瘟病毒关键毒力基因 MGF_360-4L 的探秘之旅：免疫逃逸机制与疫苗新希望
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种对养猪业极具破坏力的传染病。ASFV 是一种大型双链 DNA 病毒，其基因组庞大且复杂，编码 150 - 200 种蛋白质，但许多蛋白质的功能尚不清楚。目前，ASF 在全球范围内广泛传播，给养猪业带来了巨大的经济损失，然而却没有安全有效的疫苗来预防。

ASFV 的传播与危害

ASF 具有高度传染性，不仅能通过直接接触传播，还可借助软蜱叮咬传播。1921 年，ASF 首次在肯尼亚被发现，随后迅速从非洲蔓延至高加索地区。2007 年，它抵达格鲁吉亚，2014 年扩散到欧盟东部的大部分国家。2018 年，中国首次报告 ASF 疫情，紧接着越南、韩国等国家也相继出现疫情。ASF 的致死率极高，发病率和死亡率可达 100%，严重威胁着全球养猪业的安全。

ASFV 感染与宿主免疫反应

在病毒感染过程中，宿主细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）会识别病原体相关分子模式，从而激活先天免疫反应，诱导产生炎症因子和干扰素（interferons，IFNs）来对抗病毒。IFNs 主要由 RIG-I/MDA5、cGAS-STING 和 Toll 样受体等诱导产生，进而促使干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）转录，进一步抑制病毒感染。不过，参与 ASFV 感染的具体 PRRs 尚不完全清楚。有研究表明，ASFV 基因组富含 AT 序列，可被 RNA Pol-III 识别，引发 RIG-I 介导的先天免疫反应；但也有研究指出，ASFV 毒力基因 I267L 会损害 RIG-I 的激活和稳定性，抑制 IFN 信号传导。

MDA5 和 RIG-I 是保守的胞质 PRRs，它们通过 N 端串联半胱天冬酶激活和招募结构域（CARDs）与线粒体抗病毒信号蛋白 MAVS（也称为 IPS-1、VISA 和 Cardif）相互作用。MAVS 位于线粒体外膜，通过其 C 端跨膜结构域与 RIG-I/MDA5 的 CARD 结构域相互作用，诱导 IFN 信号传导。随后，TBK1/IKKε 被激活，导致 IRF3 和 IRF7 磷酸化并转位到细胞核，刺激 IFN 分泌。此外，MDA5 的激活还依赖于 ISG15 介导的 CARD 结构域的 ISGylation 修饰，从而刺激先天免疫反应。然而，ASFV 基因对 MDA5 的作用及相关机制尚不明确。

自噬在细胞过程中起着关键作用，它能选择性地降解受损细胞器、错误折叠的蛋白质以及捕获病原体。在 ASFV 感染时，多基因家族（Multigene family，MGF）蛋白会促进自噬以对抗先天免疫反应。例如，MGF - 300 - 2R 蛋白招募 TOLLIP 促进 IKKα 和 IKKβ 的自噬降解，损害先天免疫反应；pA137R 蛋白通过自噬溶酶体途径与 TBK1 相互作用并使其降解，抑制 IRF3 核转位和 cGAS-STING 信号激活等。但 MGF 蛋白在诱导自噬、调节宿主免疫反应和信号通路方面的具体作用，仍需进一步研究。

MGF_360-4L 蛋白的发现与研究

在之前的研究中，研究人员发现 OAS1 作为一种关键的抗病毒因子，可促进 TRIM21 介导的泛素化，增加 P72 的蛋白酶体降解，从而抑制 ASFV 复制并刺激先天免疫激活。同时，OAS1 还与几种 MGF 蛋白相互作用，暗示其潜在的作用机制。在本研究中，研究人员首次聚焦于 MGF360 - 4L 与 MDA5 的相互作用，发现它可诱导由 p62 选择性自噬受体介导的线粒体自噬，进而揭示了一种独特的免疫逃逸途径。

MGF_360-4L 抑制 IFN 信号通路

研究人员通过一系列实验发现，ASFV MGF_360-4L 蛋白能够抑制 RIG-I/MDA5 介导的 IFN 信号通路激活。将表达 MGF_360-4L 的质粒与 RIG-I、MDA5 等相关的荧光素酶报告基因共转染 HEK293T 细胞后发现，MGF_360-4L 可抑制 IFN-β 启动子和 ISRE 启动子的激活，但对 NF-κB 启动子无影响，且这种抑制作用呈剂量依赖性。RT-qPCR 分析表明，MGF_360-4L 显著抑制 IFIT1、IFIT2、STAT2 和 MX1 的转录水平，对 STAT1 和 OAS1 的转录水平也有轻微抑制，不过却增加了 ISG15 的转录水平，且在 IFN-β 存在时这种增加更为明显。这些结果表明，MGF_360-4L 负向调节 RIG-I/MDA5 介导的 IFN-β 激活。

MGF_360-4L 与 MDA5 相互作用

为了探究 MGF_360-4L 调节 IFN 信号通路的具体机制，研究人员进行了一系列实验。共免疫沉淀（Co-IP）实验表明，MGF_360-4L 特异性地与 MDA5 相互作用，而不与其他相关分子相互作用。共聚焦显微镜观察发现，MGF_360-4L 和 MDA5 在细胞的细胞质中共定位。GST pull-down 实验进一步证实了 His-MDA5 可被 GST-MGF_360-4L 拉下。

研究人员还构建了 MGF_360-4L 和 MDA5 的多个片段，以确定它们相互作用的结构域。结果发现，MGF_360-4L 的 Alpha-lactotoxin_LT1a 结构域（191 - 337aa）与 MDA5 特异性相互作用，而 MDA5 的 Helicase_C 结构域（700 - 839aa）与 MGF_360-4L 特异性相互作用。此外，对 MGF_360 家族 15 个成员的 CDS 序列进行比对后发现，MGF_360-4L 与 MGF_360–6L 的核苷酸同一性最高，且在其 Alpha-lactotoxin_LT1a 结构域内有独特的插入序列，这些差异可能有助于区分 MGF_360-4L 与其他家族成员的功能。

MGF_360-4L 抑制 MDA5 介导的 IFN 信号通路及 IRF3 核转位

研究人员进一步研究发现，MGF_360-4L 可抑制 MDA5 介导的 IFN 信号通路，并阻碍 IRF3 核转位。将 HA-MGF_360-4L 或 HA-Vec 质粒转染 HEK293T 细胞，并用水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）刺激后，Western blotting 结果显示，MGF_360-4L 特异性降低 MDA5 蛋白水平，抑制 IKKε、TBK1、IRF3 和 IRF7 的磷酸化。核质分离实验进一步证实，MGF_360-4L 阻碍 IRF3 核转位，且自身也部分进入细胞核。

为了更深入了解 MGF_360-4L 的作用，研究人员构建了 MGF_360-4L 缺失株 ASFV/CN/SC/2019-△MGF_360-4L。该缺失株在猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）中的生长曲线与野生型 ASFV 相似，但缺失 MGF_360-4L 后，对 MDA5 蛋白水平的抑制作用显著减弱，对 IRF3 和 TBK1 磷酸化的抑制也明显降低。这表明 ASFV MGF_360-4L 可能作为 IFN 反应抑制蛋白，抑制宿主先天免疫反应，促进病毒复制。

MGF_360-4L 诱导 MDA5 降解

研究发现，MGF_360-4L 可促进 MDA5 通过自噬 - 溶酶体途径降解。MGF_360-4L 以剂量依赖性方式抑制 MDA5 蛋白水平，但不影响其转录水平。用溶酶体抑制剂氯化铵（NH?Cl）、自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞后，MGF_360-4L 诱导的 MDA5 蛋白降解受到显著抑制，而蛋白酶体抑制剂 MG-132 和凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK 则无此作用，表明 MGF_360-4L 促进了 MDA5 的自噬降解。此外，MGF_360-4L 还促进了自噬标记物 LC3 的切割和 p62 的降解，共聚焦显微镜观察发现，转染 pHA-MGF_360-4L 的细胞中，mCherry-LC3B 和 EGFP-LC3B 主要在细胞核周围共定位，而在未转染的细胞中则分散分布在细胞质中。使用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理后，MGF_360-4L 对 MDA5 蛋白水平的抑制作用显著降低，IFN 信号通路的抑制也减弱。

MGF_360-4L 招募 SQSTM1 诱导线粒体自噬

激光共聚焦显微镜结果显示，MGF_360-4L 增加了细胞核周围 LCB3 阳性斑点的数量。透射电子显微镜观察发现，MGF_360-4L 有效诱导细胞自噬，且过表达 pHA-MGF_360-4L 显著影响线粒体形态，出现线粒体嵴消失和结构改变，线粒体中还存在自噬小泡，表明 MGF_360-4L 可诱导线粒体自噬。

进一步研究发现，MGF_360-4L 通过选择性受体 PARKIN/PINK1 介导的泛素依赖性途径诱导线粒体自噬。过表达 MGF_360-4L 显著降低 TOM20 和 VDAC1 的蛋白水平，促进 PARKIN 表达，抑制 PINK1 降解，但不影响 NIX 和 NDP52 的蛋白水平。感染 ASFV-WT 或 ASFV-△MGF_360-4L 的 PAM 细胞实验也证实，缺失 MGF_360-4L 可稳定 HSP60、VDAC1 和 TOM20 的蛋白水平，维持 PINK1 的降解。

研究人员还发现，MGF_360-4L 特异性地与 p62 相互作用，而不与其他自噬受体相互作用。GST pull-down 实验进一步证实了这种直接相互作用。激光共聚焦显微镜观察显示，MGF_360-4L 与 p62 在细胞核周围共定位。沉默 p62 或 ATG16L1 可抑制 MGF_360-4L 诱导的 MDA5 降解，表明 MGF_360-4L 招募 p62 诱导线粒体自噬，并通过 ATG16L1 依赖性的 PARKIN/PINK1 途径降解 MDA5。

MGF_360-4L 影响 MDA5 与 MAVS 的相互作用及 ISGylation 修饰

在病毒感染过程中，MDA5 识别病毒产生的 dsRNA 后，会招募 MAVS 传递信号并激活 IFN 信号通路。同时，MDA5 还可通过 ISG15 介导的 ISGylation 修饰激活，发挥抗病毒功能。研究发现，MGF_360-4L 抑制 MDA5 与 MAVS 的相互作用，且这种抑制作用呈剂量依赖性。共聚焦显微镜观察显示，在 MGF_360-4L 存在时，MDA5 与 MAVS 共定位并锚定在线粒体上，而在其不存在时，MDA5 分布在整个细胞质中。

此外，MGF_360-4L 抑制 ISG15 诱导的 MDA5 的 ISGylation 修饰，且自身不发生 ISGylation。在不同 MOI 感染 ASFV-WT 和 ASFV-ΔMGF_360-4L 的实验中也证实，ASFV-ΔMGF_360-4L 感染不能抑制 ISG15 对 MDA5 的 ISGylation 修饰。共聚焦显微镜观察发现，MDA5 和 ISG15 可在细胞质中共定位。这些结果表明，MGF_360-4L 抑制 MDA5 与 MAVS/VISA 的相互作用，损害 ISG15 介导的 MDA5 的 ISGylation 修饰和激活。

MGF_360-4L 被 OAS1 泛素化降解

研究人员通过实验证实，OAS1 与 MGF_360-4L 存在相互作用，且这种相互作用在外源和内源性条件下均得到验证。GST pull-down 实验进一步确认了它们的直接相互作用。研究发现，OAS1 以剂量依赖性方式抑制 MGF_360-4L 的蛋白表达，且通过泛素 - 蛋白酶体途径降解 MGF_360-4L。通过构建不同的泛素突变位点质粒进行 Co-IP 分析，发现 OAS1 通过 K6、K33、K48 和 K63 连接的多聚泛素链对 MGF_360-4L 进行泛素化。对 MGF_360-4L 片段的研究发现，其 Alpha-lactotoxin LT1a 结构域中的赖氨酸残基 290、295 和 327 是关键的泛素化位点，突变这些位点后，MGF_360-4L 的泛素化水平显著降低。

ASFV-△MGF_360-4L 在猪体内的致病性研究

为评估 ASFV-△MGF_360-4L 在猪体内的致病性，研究人员进行了攻毒实验。将猪分为不同组，分别注射 ASFV-△MGF_360-4L（20 HAD??、100 HAD??）、ASFV-WT（20 HAD??）或 RPMI 1640 作为对照。结果显示，注射 ASFV-WT 的猪在感染后 3 天出现发热，体温高达 41.7°C，持续至 7 天，随后下降，部分猪在 8 - 9 天死亡；而注射 ASFV-△MGF_360-4L 的猪仅出现轻微体温升高，随后恢复正常，且无明显临床症状，所有猪均存活。

在病毒载量方面，ASFV-WT 感染猪的血液、拭子和器官组织中的病毒基因组拷贝数明显高于 ASFV-△MGF_360-4L 感染组。组织病理学检查发现，ASFV-WT 感染猪的心脏、肝脏、脾脏等多个器官出现出血、充血和水肿等严重病变，而 ASFV-△MGF_360-4L 感染猪的病变则明显较轻。ELISA 检测结果显示，ASFV-△MGF_360-4L 感染猪的血清中可检测到抗体，且 IFN-β 水平明显高于 ASFV-WT 感染组。这些结果表明，MGF_360-4L 是 ASFV 的毒力基因，ASFV-△MGF_360-4L 在猪体内的致病性显著降低，可有效抵抗野生型 ASFV 的攻击。

研究意义与展望

本研究发现了 ASFV 的一个新的毒力基因 MGF_360-4L，它通过多种机制抑制宿主先天免疫反应，促进病毒复制。MGF_360-4L 特异性地与 MDA5 相互作用，招募 p62 诱导线粒体自噬，降解 MDA5，抑制 IFN 信号通路。同时，它还抑制 MDA5 与 MAVS 的相互作用，阻碍 ISG15 介导的 MDA5 的 ISGylation 修饰。此外，OAS1 可泛素化降解 MGF_360-4L，进一步调节其对宿主免疫反应的影响。

ASFV-△MGF_360-4L 在猪体内的毒力显著减弱，并能提供对野生型 ASFV 攻击的保护，这为 ASFV 疫苗的开发提供了新的候选方案。未来的研究可以进一步深入探究 MGF_360-4L 与其他宿主分子的相互作用，以及其在病毒感染过程中的动态变化，为开发更有效的 ASFV 防控策略奠定基础。同时，对 OAS1 等宿主限制因子的研究也有助于揭示宿主与病毒相互作用的复杂机制，为抗病毒治疗提供新的靶点和思路。