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为探究激素对兜兰分蘖的影响，中国科学院华南植物园的研究人员开展 BAP 对P. callosum分蘖作用的研究。结果发现 BAP 可促进其分蘖，还揭示了相关激素和基因调控机制。该研究为兰花培育及植物分蘖研究提供重要参考，值得一读。
在神奇的植物世界里，兰花一直备受人们喜爱，尤其是兜兰属（Paphiopedilum）的兰花，它们不仅野生数量稀少，而且花朵独特，那 pouch-shaped lip（袋状唇瓣）更是让人着迷。对于园艺爱好者和花卉产业来说，花朵的数量可是个关键因素，它直接影响着兰花的观赏价值和经济价值。而兜兰的分蘖能力（简单来说，就是从植株基部产生新分枝的能力），又和花朵数量紧密相关。
可问题来了，大多数兜兰的分蘖能力并不强。就像P. callosum、P. purpuratum等种类，它们的分蘖芽形成后，常常会进入休眠状态，就好像小懒虫一样，睡起了大觉。只有当主茎的顶端分生组织从营养生长阶段过渡到生殖生长阶段并抽薹（长出花茎）时，这些休眠的分蘖芽才会醒来，打破休眠开始生长。这就导致这些兜兰往往是单枝开花，花朵数量有限。相比之下，P. spicerianum、P. insigne等兜兰的分蘖能力就强多了，它们的分蘖芽成熟后能和主茎一起生长，不会休眠，最后呈现出多枝开花的繁茂景象。
植物激素在植物的生长发育过程中起着至关重要的作用，它就像是植物体内的小指挥家，指挥着植物的各种生理活动。研究发现，细胞分裂素（Cytokinins，CTKs）对植物侧芽的生长有积极的调控作用。在农业和园艺领域，有一种合成的细胞分裂素 —— 苄氨基嘌呤（Benzylaminopurine，BAP）被广泛使用。在苹果、甜樱桃等多年生木本植物上，给它们来点 BAP，就能刺激侧芽活跃起来，让侧枝数量增多；在小麦、燕麦等草本植物上使用 BAP，也能增加分蘖。不过，虽然 CTKs 对植物侧芽生长的调控有一些研究，但在兜兰这里，激素对其分蘖的影响还不太清楚。
为了揭开这个神秘的面纱，中国科学院华南植物园的研究人员在《BMC Plant Biology》期刊上发表了一篇名为《Exogenous benzylaminopurine promotes tillering by interacting with abscisic acid and auxin in Paphiopedilum callosum》的论文。研究发现，BAP 能促进P. callosum侧芽生长，增加分蘖数量。而且，BAP 促进分蘖的过程可不简单，它不仅改变了P. callosum体内 IAA、ABA 和 CTKs 等激素的含量，还调控了和代谢、休眠相关的基因。这一研究成果，为进一步探索兜兰属植物以及其他非模式植物分蘖发育的机制，打下了坚实的基础。
研究人员在这项研究中用到了好几种关键技术方法。他们通过石蜡切片技术，对P. callosum和 * P. ‘SCBG Yingchun’* 的茎尖进行切片观察，了解分蘖芽的发育过程；运用 UPLC-ESI-MS/MS 系统来测定植物体内激素的含量；利用 RNA 测序技术，分析不同处理下分蘖芽发育过程中基因的表达变化；最后，采用 qRT-PCR 技术，对一些关键基因的表达进行验证。
下面我们一起来看看具体的研究结果。
1. 兜兰分蘖芽的形成和生长
成熟的兜兰植株通常有 4 - 5 片叶子，这些叶子把茎基部遮得严严实实的。分蘖芽就藏在每片叶子和短缩茎之间的夹角里。研究人员通过石蜡切片观察发现，分蘖芽从腋芽分生组织开始形成，接着会逐渐长出第一片、第二片、第三片叶原基。当第四片叶原基出现时，分蘖芽就成熟啦，具备了快速伸长的能力，然后突破母株，成为一个正常的分蘖。不过，不同种类的兜兰在分蘖能力上差别很大。P. callosum的分蘖能力较弱，成熟的分蘖芽会进入 5 - 7 个月的休眠期，所以它通常是单枝开花。而 * P. ‘SCBG Yingchun’* 的分蘖能力很强，分蘖芽成熟后会持续伸长生长，和主茎同步，最终呈现出多枝开花的样子。
2. 外源 BAP 促进P. callosum分蘖芽和根的发育
研究人员给P. callosum浇灌不同浓度的 BAP 溶液，看看会发生什么。结果发现，100、200、400 和 1000mg/L 的 BAP 都能促进分蘖芽的生长。处理 100 天后，母株上就能看到分蘖芽形成啦。而且，不同浓度的 BAP 促进效果还不一样。400mg/L 的 BAP 效果最明显，处理 100 天后，分蘖芽数量显著增加到 3.41 个，第一个分蘖芽的平均高度达到 4.32cm。再提高 BAP 浓度到 1000mg/L，效果反而不如 400mg/L 的处理。所以，400mg/L 的 BAP 被选为促进P. callosum分蘖生长的最佳浓度。
研究人员还发现，400mg/L 的 BAP 处理 30 天后，P. callosum茎基部就会出现 4 个突出的芽点，这是休眠释放阶段；60 天后，这些分蘖芽开始膨大、变绿，突破母株，进入膨大阶段；之后，分蘖芽继续生长，长出新叶，成为新的分蘖苗，这就是持续生长阶段。另外，低浓度（100 和 200mg/L）的 BAP 虽然对分蘖芽的促进作用不如高浓度，但能促进新根的产生。
3. 400mg/L BAP 处理对休眠释放阶段内源激素含量的影响
既然 BAP 能促进分蘖芽生长，那它会不会影响植物体内激素的含量呢？研究人员测定了用 400mg/L BAP 处理 30 天后植株体内各种激素的含量。结果发现，和对照组相比，BAP 处理后，ABA、GA?以及一些细胞分裂素（如 iP、tZ、cZ）的含量显著降低；而 IAA 和另外一些细胞分裂素（如 BAP、oT、pT）的含量则显著升高。此外，细胞分裂素糖苷（如 iP9G、cZ9G、K9G、BAP7G）的含量变化不太一样，iP9G 和 K9G 含量增加，cZ9G 和 BAP7G 含量减少。
4. 400mg/L BAP 处理下分蘖芽发育的转录组分析
为了深入了解 BAP 促进分蘖的分子机制，研究人员对 400mg/L BAP 处理下不同发育阶段（0d、30d、60d、100d）的分蘖芽进行了转录组测序。通过测序，他们得到了大量的干净数据，并组装出了 54,728 个 unigenes（单基因），其中很多都能在公共数据库中找到对应的功能注释。
研究人员还分析了不同发育阶段的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。他们发现，在不同的比较组中，差异表达基因的数量和功能都不一样。比如，在 S0 和 S1 的比较组中，和植物激素信号转导、核糖体、DNA 复制相关的通路被激活，这可能有助于腋芽的激活；在 S1 和 S2 的比较组中，淀粉和蔗糖代谢、氮代谢、脂肪酸降解相关的基因显著富集，说明这些物质可能参与了分蘖芽从母株中长出和进一步伸长的过程；在 S2 和 S3 的比较组中，光合作用、光合天线蛋白、苯丙烷生物合成相关的通路高度富集，这意味着分蘖芽持续生长需要更多的能量。
通过对差异表达基因的表达趋势分析，研究人员发现有 4 个基因簇（K1、K2、K3、K4）的基因可能参与了 BAP 处理下分蘖芽生长发育的调控。对这些基因进行 GO 富集分析后发现，细胞分裂素代谢过程、细胞分裂素脱氢酶活性、脱落酸结合等功能显著富集，这表明 CTKs 和 ABA 在P. callosum分蘖芽发育过程中都起着重要作用。
5. CTKs 生物合成、降解和信号基因的表达谱
CTKs 的合成、降解和信号传导对植物的生长发育至关重要。研究人员在P. callosum中找到了 4 个 IPT（腺苷酸异戊烯基转移酶）的同源基因、9 个 CKX（细胞分裂素氧化酶 / 脱氢酶）的同源基因，以及 1 个 CYP735A 和 1 个 LOG（核糖核苷 5'- 单磷酸磷酸核糖水解酶）的同源基因。其中，3 个细胞分裂素合成基因（IPT1、CYP735A1、LOG3）呈现出不同的表达模式，大多数 CKX 基因家族成员对 BAP 处理表现出上调响应。
在细胞分裂素信号传导方面，P. callosum有多个与信号传导相关的基因，如HK、HP、A - type RRs 和 B - type RRs。转录组分析表明，6 个编码 B - type RRs 的基因在 S1、S2 和 S3 阶段被 BAP 显著上调，而 2 个 A - type RR 基因则显著下调。
6. 生长素和 ABA 生物合成、降解和信号相关 DEGs 的表达谱
除了 CTKs，生长素（Auxin）和 ABA 在分蘖发育中也起着关键作用。研究人员注释了 28 个与生长素生物合成、降解、运输和信号转导相关的 DEGs。在生长素合成途径中，YUCCA基因在 S1 - S3 阶段上调，DAO基因则下调；在运输方面，4 个生长素转运蛋白基因（PIN1C、ABCB19、PILS1、LAX3）在 S1 - S3 阶段都上调。这些结果表明，IAA 在P. callosum分蘖芽生长过程中发挥着积极作用。
对于 ABA，研究人员分析了其生物合成、代谢和信号传导相关基因的表达。在生物合成方面，有 3 个相关的 DEGs，其中 2 个ZEP基因在 S1 - S3 阶段上调，1 个NCED基因下调；在代谢方面，4 个CYP707A家族基因表达模式不同，CYP707A7在 S1 - S3 阶段显著上调；在信号传导方面，6 个 DEGs 呈现出复杂的表达模式。
7. 参与分蘖芽生长的 DEGs 的表达谱
除了激素相关基因，和休眠、糖代谢、能量代谢相关的基因也可能在 BAP 处理下对分蘖生长发挥重要作用。研究发现，一些和休眠相关的基因（如DRM1、SVP）在 S1 - S3 阶段对 BAP 处理表现出下调响应，这表明 BAP 可能通过解除分蘖芽的休眠来促进其发育。同时，参与海藻糖 6 - 磷酸（T6P）形成的基因（如TPS1、TPP）以及一些糖转运蛋白基因在 S2 阶段显著上调，说明 CTKs 可能和糖相互作用，调控分蘖芽从 S1 到 S2 的转变。此外，和能量生产、转换以及碳水化合物运输、代谢相关的基因在 S3 阶段显著上调，这意味着分蘖芽在这个阶段增强了对营养物质的竞争能力。
8. 两种不同分蘖能力兜兰中与分蘖相关候选基因表达模式的比较
研究人员选择了分蘖能力强的P. ‘SCBG Yingchun’作为对照，通过 qRT-PCR 验证和比较了两种兜兰在分蘖发育过程中基因的表达模式。结果发现，和未处理的P. callosum相比，BAP 处理后的P. callosum在芽生长过程中，两个休眠相关基因的表达降低。在P. ‘SCBG Yingchun’中，PcDRMH1基因的相对 mRNA 水平只有未处理P. callosum的 1/7，PcSVP基因的表达趋势和 BAP 处理后的P. callosum相似。这表明 BAP 可能诱导分蘖芽解除休眠，促进分蘖发育。
此外，ABA 分解代谢基因PcCYP707A在 BAP 处理后表达显著增加，而编码 ABA 关键响应调节因子的PcABF2基因则下调。生长素转运蛋白基因PcPIN1和生长素合成基因PcYUC2在 BAP 处理后的P. callosum和 * P. ‘SCBG Yingchun’* 中表达上调，这说明 BAP 在分蘖芽生长阶段影响了 ABA 分解代谢和 IAA 运输的调控。
9. 利用 qRT-PCR 验证基因表达
研究人员挑选了 12 个和内源激素、糖合成、代谢、运输以及腋芽形成和维持相关的 DEGs，用 qRT-PCR 来验证转录组数据的准确性。结果发现，qRT-PCR 的结果和转录组数据基本一致。比如，2 个 CTKs 分解代谢基因（CKX5和CKX10）以及 CTKs 信号通路的负调控因子RR10在 400mg/L BAP 处理后显著上调；3 个和 IAA 合成、运输、信号相关的基因也呈现出相同的趋势。另外，一些和独脚金内酯（strigolactones，SLs）生物合成、糖生物合成和运输相关的基因在 S2 阶段表达最高；和腋芽形成相关的SCL18基因在四个分蘖芽发育阶段相对表达没有显著差异；抑制腋芽伸长和生长的TB1基因在 S1 阶段显著下调。
综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。研究人员发现，BAP 促进P. callosum分蘖的过程中，涉及到和 ABA、IAA 的相互作用。BAP 处理使得 ABA 含量降低，ABA 分解代谢基因PcCYP707A上调；同时，IAA 含量增加，IAA 合成基因PcYUC2上调。此外，BAP 还能下调休眠基因PcDRM1和PcSVP的表达，让休眠的分蘖芽重新活跃起来，并且上调 IAA 运输基因PcPIN1C，支持分蘖芽持续生长。
这一研究成果不仅让我们对兜兰属植物分蘖发育的机制有了更深入的了解，也为园艺工作者们提供了实用的指导。以后在培育兜兰时，可以合理利用 BAP 来提高它们的分蘖能力，增加花朵数量，让兜兰在花卉市场上更加绚丽多彩，满足人们对美的追求，同时也为花卉产业带来更多的经济效益。而且，该研究为其他非模式植物分蘖发育机制的研究提供了重要参考，就像一把钥匙，为解开更多植物生长发育的奥秘打开了一扇门。
