从双峰驼中寻得 “解药”：新型单域抗体对抗肉毒毒素 A 型的突破之旅

为解决肉毒毒素（BoNT）中毒无特效药物的问题，北京药理毒理研究所的研究人员开展针对 BoNT/A 单域抗体的研究，获得中和抗体 HM。该研究为防治 BoNT 中毒提供新方向，强烈推荐科研读者阅读。

　　

肉毒杆菌神经毒素（BoNT）是由厌氧细菌肉毒梭菌产生的一种毒性极强的毒素，它就像一个隐藏在暗处的 “杀手”，一旦进入人体，就会引发神经麻痹，严重时甚至会导致死亡。BoNT 分为 A - G 七种不同的血清型，其中 A、B、E 和 F 型是导致人类肉毒中毒的主要 “元凶” 。人类肉毒中毒主要有四种形式：吃了被肉毒毒素污染食物引发的食源性肉毒中毒；细菌在肠道定植导致的婴儿肉毒中毒和成人肠道肉毒中毒；伤口被肉毒梭菌感染引起的伤口肉毒中毒；还有因治疗使用 BoNT/A 和 BoNT/B 不当引发的医源性肉毒中毒。而且，肉毒毒素的毒性极强，小鼠的半数致死剂量（）仅为 0.1 - 1 ng/kg，虽然人类的准确还不明确，但从灵长类动物的研究推测，静脉或肌肉注射 1 - 2 ng/kg、吸入 10 ng/kg、口服 1 μg/kg 就可能致命，因此它被美国疾病控制与预防中心列为 A 类生物威胁剂。

目前，针对肉毒中毒，并没有特效药物。现有的主要治疗方式是监测、支持性护理和抗毒素治疗，比如使用马源七价肉毒抗毒素（BAT?），但它是一种异源蛋白，容易引发过敏反应，带来血清病、淤血等副作用。在这样的背景下，寻找安全有效的抗肉毒毒素药物迫在眉睫。

为了解决这一难题，北京药理毒理研究所的研究人员在《Heliyon》期刊上发表了一篇名为 “A novel single - domain antibody obtained from immune Bactrian camels against botulinum toxin type A using SPR - based screening method” 的论文。他们经过一系列研究，成功获得了一种针对肉毒毒素 A 型的高亲和力中和抗体 HM，为肉毒毒素中毒的防治带来了新希望。

研究人员在这项研究中运用了多种技术方法。首先是噬菌体展示技术，通过它构建纳米抗体噬菌体库，就像是建立了一个充满各种潜在 “解药” 的宝库。然后利用表面等离子共振（SPR）技术，这一技术能够精准地检测抗体与抗原之间的亲和力，帮助研究人员从众多抗体中筛选出有潜力的 “种子选手”。还有计算机辅助同源建模技术，它可以模拟分子的三维结构，让研究人员从原子层面了解抗体与抗原的结合模式。

下面来看看具体的研究结果：

• 发现和表征新的 VHH（可变结构域重链抗体^{[注释 1]}）：研究人员挑选了一只名叫 L9 的双峰驼进行免疫，用 BoNT/A 的受体结合域（）作为抗原，经过五次免疫和一次加强免疫后，骆驼血清抗体滴度达到 1:8000，满足构建抗体库的要求。接着构建了容量为噬菌粒、准确率超 80% 的噬菌体展示库。在筛选 VHH 时，先用经典 ELISA 方法直接包被抗原，经过四轮筛选，噬菌体库显著富集，发现 A1 抗体与的亲和力为M，但 A1 在体内实验中无法保护小鼠免受剂量的 BoNT/A 的伤害。后来推测并验证 A1 结合在的非活性位点，于是利用 A1 作为支架抗体，采用间接筛选法，成功筛选出亲和力更高（M）的中和抗体 HM。
• 功能性抗体、非功能性抗体与的结合模式：研究人员通过计算机辅助同源建模，模拟了肉毒毒素 A 重链和其受体 SV2C 结构域 4 的三维结构。发现与 SV2C 结合的关键残基，以及 HM 和 A1 与的结合位点。HM 能与 SV2C 竞争结合的受体结合域，而 A1 结合在远离 SV2C 结合位点的地方。
• VHH 抑制肉毒毒素 A 型与 SV2C 的结合：通过计算机同源建模分析抗体与的结合位点，初步推测 HM 通过阻断与受体的相互作用发挥功能。再利用 SPR 竞争实验进一步验证，随着 HM 浓度增加，与 SV2C 结合的信号（Ru 值）下降，表明 HM 确实可以阻断它们的结合。
• VHH 抑制肉毒毒素 A 型结合细胞：研究人员选取 Neuro - 2a 细胞进行免疫染色分析，用 Alexa Flour 488 标记的能与 Neuro - 2a 细胞结合，但加入 HM 后，结合被阻断，且荧光强度随 HM 浓度增加而显著降低，说明 HM 在细胞水平上也能有效阻断与神经元受体的结合。
• VHH 中和小鼠体内的毒素中毒：在小鼠体内实验中，用不同浓度的 HM 与 BoNT/A 混合后腹腔注射给小鼠。结果显示，低至 0.05 - 5 mg/kg 的 HM 就能完全保护小鼠免受剂量的 BoNT/A 的致死伤害；当毒素剂量增加到和时，10 mg/kg 的 HM 仍能保护部分小鼠，还能延长小鼠的存活时间。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员成功获得了针对肉毒毒素 A 型的中和抗体 HM，它在体外和体内都展现出强大的阻断和保护能力。在筛选抗体的过程中，研究人员发现保持抗原的天然构象和暴露关键表位对于筛选有功能活性的抗体至关重要。同时，基于 SPR 的筛选策略也被证明是有效的，它能确保抗原处于天然状态，准确评估抗体与活性位点的功能结合，为未来筛选更多功能性抗体奠定了坚实基础。虽然目前只对 A1 和 HM 这两种最具代表性的抗体进行了详细分析，但其他候选抗体也有潜在的应用价值。未来，研究人员还计划深入研究抗原表位分析和计算建模，探索纳米抗体的开发和应用，优化人源化抗体，提高其在体内的半衰期，增强对肉毒毒素中毒的防治效果，为人类健康保驾护航。

注释 1：可变结构域重链抗体（VHH），也叫单域抗体（sdAbs）或纳米抗体，是骆驼科动物特有的重链抗体可变区，是目前已知最小的具有完整抗原结合功能的抗体结构。