CRISPR 筛选平台解锁 iPSC 小胶质细胞秘密，直击阿尔茨海默病脂质代谢谜题

为解决阿尔茨海默病（AD）中 APOE 影响脂质代谢机制不明的问题，罗氏公司等机构的研究人员开展 iPSC 衍生小胶质细胞的 CRISPR 筛选研究。他们发现 mTORC1 通路调节脂质储存，该成果为 AD 研究提供新思路，值得一读。

　　

在神经科学的神秘领域里，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）一直是研究者们重点关注的对象。AD 的病理特征十分复杂，不仅有标志性的淀粉样斑块和 tau 蛋白缠结，脂质负荷的神经胶质细胞也在其中扮演着重要角色。载脂蛋白 E（Apolipoprotein E，APOE）作为 AD 的主要风险基因，与脂质代谢密切相关，在 AD 患者的人类小胶质细胞中高度上调。然而，尽管越来越多的遗传证据表明，神经胶质细胞的脂质功能障碍在 AD 的病理生理过程中发挥着作用，且部分是通过 APOE 起作用，但具体的机制却如同隐藏在重重迷雾之中，让人难以捉摸。

这背后的一个重要原因是，长期以来，缺乏有效的方法对包括小胶质细胞在内的髓系细胞进行基因操作。以往基于 CRISPR 的小胶质细胞研究，通常是在多能干细胞阶段进行基因操作，这对于高内涵分析的阵列筛选来说是个巨大挑战，也难以区分成熟细胞中发育和功能的影响。为了揭开这些谜团，来自罗氏公司（F. Hoffmann-La Roche Ltd）等机构的研究人员在《Stem Cell Reports》期刊上发表了题为 “An efficient, non-viral arrayed CRISPR screening platform for iPSC-derived myeloid and microglia models” 的论文。他们成功开发出一种高效、非病毒的阵列 CRISPR 筛选平台，用于诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源的髓系和小胶质细胞模型研究，还发现了 mTORC1 信号通路在调节小胶质细胞脂质储存中的关键作用，这一成果为理解 AD 相关的脂质代谢紊乱机制带来了新的曙光。

研究人员在此次研究中，用到了几个关键技术方法。首先是优化的 CRISPR-Cas9 核转染技术，他们通过优化核转染条件，将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（RNP）复合物高效导入 iPSC 衍生的巨噬细胞和小胶质细胞中，实现基因编辑；其次是构建了包含 334 个与神经退行性变和脂质稳态相关基因的靶向 sgRNA 文库，用于阵列筛选；最后利用尼罗红（Nile red，NR）染色和高内涵成像技术，对脂质滴进行可视化和定量分析。

下面我们具体来看看研究的结果。

APOE 调节 iPSC 衍生小胶质细胞中的脂滴积累

为了找到调节脂滴形成的基因，研究人员构建了相关模型。他们从携带不同 APOE 等位基因或 APOE 基因敲除（KO）的同基因 iPSC 中，分化出小胶质细胞和巨噬细胞，并对其 APOE 脂质滴表型进行了深入研究。通过用尼罗红染色，研究人员发现，与 APOE3 相比，APOE KO 的小胶质细胞中脂滴数量显著增加，APOE4 的小胶质细胞脂滴含量虽有增加趋势但不显著。有趣的是，APOE KO 还使小胶质细胞的细胞大小明显增大。在巨噬细胞中，APOE KO 和 E4 的脂滴数量也比 E3 显著增加。综合这些结果，研究人员选择了 APOE KO 和 APOE3 小胶质细胞来筛选脂质调节剂。

优化 CRISPR-Cas9 核转染用于 iPSC 衍生的巨噬细胞

为了在不影响细胞抗病毒特性的前提下，实现 iPSC 衍生髓系细胞的高效基因敲除，研究人员对巨噬细胞的 CRISPR-Cas9 核转染方案进行了优化。他们从基于外周血单个核细胞（PBMCs）的核转染方案出发，对不同基础培养基、脉冲代码设置和 Cas9:sgRNA 比例进行了测试。最终确定了 DMEM/F12 和 RPMI 1640 作为合适的培养基，CM-137 为最佳脉冲代码，2 mg Cas9:25 nmol sgRNA 为最优的 RNP 形成比例。通过敲除 Toll 样受体 4（TLR4）验证了该优化方案的功能性，成功建立了通过核转染 CRISPR-Cas9 调节巨噬细胞功能的方法。

CRISPR-Cas9 核转染在发育中和成熟的 iPSC 衍生小胶质细胞和巨噬细胞中的应用

研究人员进一步测试该核转染方法在其他髓系细胞中的适用性。他们对成熟小胶质细胞（分化第 10 天）和前体巨噬细胞（preMacs）进行核转染实验，结果显示，在所有测试条件下，CD81 基因敲除效率均超过 80% 。考虑到小胶质细胞在培养 15 天后会从培养表面脱落，研究人员选择在 preMacs 阶段进行核转染。后续研究发现，核转染对小胶质细胞的激活状态、经典功能以及 APOE 依赖的脂质表型均无显著影响，表明该方法可用于 iPSC 衍生的小胶质细胞和巨噬细胞的基因编辑。

对 iPSC 衍生小胶质细胞进行阵列筛选，揭示脂滴形成的正负调节因子

研究人员利用优化后的核转染方法，开展了阵列基因敲除筛选。他们构建了一个包含 334 个基因的靶向 sgRNA 文库，每个基因有 3 个 sgRNA ，分布在 4 个 96 孔板中。实验结束后，通过流式细胞术评估基因敲除效率，用尼罗红染色分析脂滴。经过一系列数据处理和分析，他们确定了脂滴调节因子。大多数筛选出的基因增加了 APOE3 和 APOE KO 小胶质细胞的脂质含量，敲除甾醇 O - 酰基转移酶 1（SOAT1）能显著降低脂质积累，且许多与溶酶体功能或调节以及 mTORC1 通路相关的基因也影响脂质含量。

比较基因敲除对脂质含量的影响，揭示关键通路

为了探索调节脂质含量的通路及其对 APOE 的依赖性，研究人员进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。结果发现，在 APOE3 和 APOE KO 小胶质细胞中，sgRNA 文库的一些主要通路均有富集，但也存在差异，如胆固醇代谢途径中的富集基因在两种细胞系中大部分不重叠。进一步通过 DAVID 生物信息数据库进行富集分析，发现 mTOR 信号通路在 APOE3 小胶质细胞中得分最高，而自噬、线粒体自噬和人乳头瘤病毒（HPV）感染通路在 APOE KO 小胶质细胞中显著富集。比较不同细胞系中的单个基因敲除效果，发现 APOE3 小胶质细胞中增加脂质含量的靶点更多，不过两种细胞系在影响 mTORC1 通路的基因上有显著相似性。

mTORC1 信号是 iPSC 衍生小胶质细胞中脂滴形成和细胞大小的关键调节因子

研究人员对 mTORC1 信号通路相关基因进行敲除验证。敲除结节性硬化症复合物亚基 2（TSC2）会激活 mTORC1，使两种基因型的脂质含量均显著降低；而敲除激活 mTORC1 信号的基因，如 Ras 同源脑富集蛋白（RHEB）、雷帕霉素靶蛋白复合物 1 调节相关蛋白（RPTOR）和 mTOR 本身，则会增加脂质含量 。研究人员选取 RHEB 和 TSC2 进行敲除验证，结果与 CRISPR - Cas9 筛选结果一致，且发现 RHEB 敲除对脂滴形成和细胞大小的影响比长期使用雷帕霉素处理更强，TSC2 敲除的影响可被雷帕霉素逆转，表明 mTORC1 信号在调节 iPSC 衍生小胶质细胞的脂质储存中起着重要作用。

总的来说，这项研究成功开发了一种高效的非病毒阵列 CRISPR 筛选平台，用于 iPSC 衍生的髓系和小胶质细胞模型。研究人员通过该平台确定了 APOE 调节脂质代谢的相关基因，发现 mTORC1 信号通路是脂质储存的关键调节因子。这不仅为理解 AD 相关的脂质代谢紊乱机制提供了重要线索，也为开发新的治疗策略带来了希望。同时，该研究建立的筛选平台为后续研究其他神经退行性疾病相关的脂质代谢问题提供了有力工具，有助于推动神经科学领域的进一步发展。