惊！番茄胚胎发育和种子耐旱性的关键 —— 核 RNA 聚合酶 D1

为解决 DNA 甲基化如何调控植物胚胎发育的问题，中国科学院植物研究所的研究人员以番茄为对象研究 SlNRPD1 基因。结果发现其对番茄胚胎发育和种子耐旱性至关重要。该研究为相关领域提供新视角，推荐科研读者阅读。

　　

在植物的生长发育过程中，DNA 甲基化（在不改变基因序列的情况下，对染色质进行化学修饰，从而调控基因表达）起着至关重要的作用。它能抑制转座子（TEs，一种可以在基因组中移动的 DNA 序列）的活性，还能帮助植物应对环境压力。与动物不同，植物基因组中有大量的 mCHG 和 mCHH 位点，其中 mCHH 位点的甲基化水平是衡量 RNA 指导的 DNA 甲基化（RdDM）活性的重要指标 。

植物胚胎发育的一个显著特征是 RdDM 活性升高，在这个过程中，CHH 甲基化会不断增加，并在成熟胚胎中达到峰值。RNA 聚合酶 IV（RNA Pol IV）是 RdDM 途径中的关键角色，它的最大亚基由 Nuclear RNA Polymerase D1（NRPD1）编码。研究发现，不同植物中 NRPD1 突变体的表现各不相同。在拟南芥中，NRPD1 突变体在营养生长阶段似乎没有明显异常，其生殖表型也不强烈；而在荠菜中，crnrpd1 花粉会在小孢子阶段停滞发育，种子结实率大幅下降；在油菜中，brnrpd1 突变体的种子结实率也显著降低，且种子变小、种皮颜色变深；水稻中，OsNRPD1a 和 OsNRPD1b 的双敲除或双 knockdown 会导致植株矮化、穗变小和分蘖增多 。然而，番茄中约 60% 的基因组由重复元件组成，slnrpd1 突变体却无法通过种子繁殖，这表明不同物种中 nrpd1 种子的发育异常不能仅仅归因于 TE 含量的差异 。而且，目前关于胚胎 RdDM 对富含 TE 的植物基因表达的全局影响还没有相关记录，为什么 RdDM 的缺失只在某些物种中导致胚胎缺陷，这仍是一个未解之谜。

为了深入探究这些问题，中国科学院植物研究所的研究人员在《Cell Reports》期刊上发表了题为 “NUCLEAR RNA POLYMERASE D1 is essential for tomato embryogenesis and desiccation tolerance in seeds” 的论文。他们通过研究发现，SlNRPD1 的缺失会导致番茄胚胎发育异常和种子对干燥的耐受性降低。这一研究为揭示 DNA 甲基化如何调控植物胚胎发育提供了重要线索。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种技术方法。他们通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建了番茄 SlNRPD1 基因的敲除突变体；利用 sRNA 测序（sRNA-seq）分析了突变体和野生型胚胎中小 RNA（sRNA）的表达谱变化；借助全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing）检测了 DNA 甲基化水平的改变；还使用 RNA 测序（RNA-seq）来探究基因表达的差异。这些技术手段就像是研究人员手中的 “秘密武器”，帮助他们一步步揭开植物胚胎发育的神秘面纱。

Loss of SlNRPD1 causes embryonic defects and darker seeds

研究人员发现，番茄 RNA Pol IV 的最大亚基由单拷贝基因 SlNRPD1 编码。他们利用 CRISPR-Cas9 技术创建了 SlNRPD1 的敲除突变体，结果发现，突变体植株产生的种子有 17% 是黑色的，且这些黑色种子的重量比野生型种子轻，但大小相近 。进一步研究发现，黑色种子大多是纯合的 slnrpd1 突变体，这表明黑色种子与 slnrpd1 突变之间存在遗传连锁。通过观察突变体胚胎的发育情况，研究人员发现，突变体胚胎在开花后 16 天开始出现异常，子叶明显缩短，部分胚胎的子叶数量变为 3 - 4 片，而且子叶与茎尖分生组织之间的界限不清晰或融合。这些结果表明，SlNRPD1 的突变导致了番茄胚胎发育异常和种子败育。

Loss of SlNRPD1 leads to a burst of 21/22-nt sRNA and SlDCL2b/c/d expression

为了研究 slnrpd1 突变对 sRNA 的影响，研究人员对野生型和突变体胚胎进行了 sRNA 测序。结果发现，SlNRPD1 的缺失导致 24-nt sRNA 显著减少，而 21/22-nt sRNA 大量增加。进一步分析发现，21/22-nt sRNA 主要来源于远端和近着丝粒基因，且这些 sRNA 的积累与 SlDCL2b/c/d 的激活有关。研究人员推测，SlDCL1/2/4 可能被激活以补偿 24-nt sRNA 的缺失，因为 21/22-nt sRNA 是参与非经典 RdDM 的内切核糖核酸酶 DCL1/2/4 的产物，而 24-nt sRNA 是参与经典 RdDM 的 DCL3 的产物 。实验结果也证实，SlDCL2b/c/d 在 slnrpd1 转录组中显著上调，且其表达可能是由于 SlDCL2b/c/d 位点特异性低甲基化而被释放。

Loss of SlNPRD1 results in CHH hypomethylation in chromosome arms but hypermethylation in pericentric TE

通过全基因组亚硫酸氢盐测序分析，研究人员发现，slnrpd1 突变体胚胎在 mCHH 位点呈现出明显的低甲基化模式，在远端基因和 TEs 中 mCHH 显著降低，但在近着丝粒基因和 TEs 中却出现了 mCHH 高甲基化的现象 。进一步研究发现，这种高甲基化主要发生在 Gypsy 反转录转座子中，而不是 DNA 转座子。研究人员还尝试通过敲除 SlDMLs（编码 DEMETER 样 DNA 去甲基化酶）来提高 slnrpd1 胚胎的甲基化水平，但结果发现，敲除后黑色种子的比例并没有显著变化，这表明经典 RdDM 位点与 SlDML 介导的去甲基化位点之间几乎没有重叠。

Comparison of Arabidopsis, rice, and tomato nrpd1 transcriptomes

研究人员对拟南芥、水稻和番茄的 nrpd1 转录组进行了比较。他们发现，在 slnrpd1 胚胎中，有 2736 个基因显著上调，只有 160 个基因显著下调 。GO 和 KEGG 通路分析显示，下调基因主要富集在血红素结合和植物激素信号转导等方面，而上调基因则主要富集在植物激素信号转导、植物 - 病原体相互作用、苯丙烷生物合成等途径。与拟南芥和水稻的 nrpd1 突变体相比，番茄中受影响的基因表达谱有明显差异，这表明 RNA Pol IV 失活对番茄基因表达的影响具有独特性。

Darker seeds of slnrpd1 accumulate flavonoids

研究人员推测，slnrpd1 种子颜色变深可能与类黄酮的积累有关。通过比色法检测，他们发现 slnrpd1 种子中可溶性原花青素和总类黄酮的含量更高，这表明 slnrpd1 种子确实积累了更多的类黄酮聚合物。这一结果为解释突变体种子颜色变化提供了有力证据。

Defective slnrpd1 embryo is related to aberrant auxin and WOX signaling

研究发现，slnrpd1 胚胎中生长素外排载体 SIPIN3 和 SIPIN5 显著上调，生长素响应报告基因 DR5rev::3xVENUS 的表达也发生了变化，在突变体种子中，生长素响应异常激活，且信号持续时间更长 。同时，与 WUS 相关的同源框转录因子 SlWOX3a 在突变体中不表达，而 SlWOX2 和 SlWOX5 则显著上调。原位杂交结果显示，SlWOX5 在突变体胚胎中的表达区域扩大。这些结果表明，经典 RdDM 的缺失破坏了 WOX 和生长素信号通路，可能导致突变体胚胎中分生组织形成异常。

slnrpd1 embryo fails to survive post-harvest desiccation

研究人员对未成熟的 slnrpd1 胚胎进行体外培养，发现部分胚胎在培养 4 周后能够发育出根和芽，但仍有 47% 的胚胎在根和芽的生长方面存在严重缺陷 。通过组织学染色，他们发现干燥后的 slnrpd1 胚胎对伊文思蓝染料具有高渗透性，且种子中的脂质和淀粉含量减少，这表明突变体胚胎无法耐受干燥，其成熟过程受到了损害，可能是导致种子败育的原因之一。

在这项研究中，研究人员通过一系列实验，深入探究了 RNA Pol IV 在番茄胚胎发育中的作用。他们发现，SlNRPD1 的缺失会导致番茄胚胎发育异常和种子对干燥的耐受性降低，这主要是由于异常的 WOX / 生长素信号通路以及转座子表达的改变。此外，他们还发现 slnrpd1 胚胎中存在非经典 RdDM 途径的补偿性增加，以及近着丝粒 TEs 的 CHH 高甲基化现象。这些结果为理解 DNA 甲基化如何调控植物胚胎发育提供了重要的理论依据，也为后续研究植物胚胎发育的分子机制奠定了基础。

不过，该研究也存在一些局限性。研究人员只在开花后 21 天对胚胎进行了 DNA 甲基组、转录组和 sRNA 的分析，这可能无法完全反映 RNA Pol IV 在胚胎发育早期的作用 。此外，研究中可能低估了 TEs 或 TE 衍生的 sRNAs 的重要性，且对于 sRNA 积累与靶基因表达之间的关系以及 sRNAs 的反式作用功能还不清楚。未来的研究可以针对这些问题进一步深入探索，以更全面地揭示植物胚胎发育的奥秘。