《Nature》SPO11 二聚体体外催化 DNA 双链断裂，解锁减数分裂重组奥秘

为解决 SPO11 活性难以体外重建、减数分裂 DSB 形成机制不明的问题，比利时鲁汶大学研究人员开展 SPO11 体外催化研究，发现其可在体外催化 DSB，且二聚化是关键。该成果对理解减数分裂重组机制意义重大，值得科研读者一读。

　　

在生物的繁衍过程中，减数分裂（Meiosis）起着至关重要的作用，而 DNA 双链断裂（DSB）的形成则是减数分裂重组的起始关键步骤。SPO11 作为引发减数分裂重组的 DNA 切割亚基，自发现以来已有 25 年之久，但它的活性却一直难以在体外进行生化重建。这就好比在拼图游戏中，缺失了关键的几块拼图，导致科学家们始终无法清晰地了解减数分裂双链断裂形成的具体机制和调控方式，仿佛迷雾笼罩，难以窥探其中的奥秘。

为了拨开这层迷雾，来自比利时鲁汶大学生物分子科学与技术研究所（Louvain Institute of Biomolecular Science and Technology, Université Catholique de Louvain）的研究人员决心深入探索。他们的研究成果发表在《Nature》期刊上，论文题目为 “SPO11 dimers are sufficient to catalyse DNA double - strand breaks in vitro”。这项研究如同点亮了一盏明灯，为我们揭示了减数分裂 DSB 形成的重要机制，发现 SPO11 二聚体足以在体外催化 DNA 双链断裂，这一结论对深入理解减数分裂重组的调控机制具有重要意义，仿佛为我们打开了一扇通往细胞奥秘的新大门。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种关键技术方法。他们利用蛋白质纯化技术，从昆虫细胞中成功获取了研究所需的蛋白质。通过凝胶电泳技术，对蛋白质的相关特性以及 DNA 的切割产物进行分析，就像用一把精密的尺子，精确测量和观察各种物质的变化。还借助结构建模技术，构建出蛋白质与 DNA 的结合模型，帮助他们更直观地理解分子间的相互作用，如同搭建了一个微观世界的模型，让原本看不见的分子世界变得清晰可见。

下面我们来详细看看他们的研究结果。

小鼠 SPO11 在体外可切割 DNA

研究人员从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化出带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的小鼠 SPO11。在体外实验中，他们将蛋白质与质粒 DNA 和二价金属离子一起孵育，结果发现 SPO11 能够产生单链（缺口）、双链（线性）和多个 DSB，这表明小鼠 SPO11 即使在没有体内所需的任何伙伴蛋白的情况下，也具有内在的双链 DNA 切割活性。当他们把 SPO11 中串联的活性位点酪氨酸残基（Y137 和 Y138）突变为苯丙氨酸（Y137F/Y138F）时，切割活性就消失了。而且，切割活性还依赖于二价金属离子的存在，其中比更有效，也能支持低水平的切割，这就像是给 SPO11 的切割活性加上了 “开关”，不同的金属离子有着不同的 “控制效果”。

SPO11 与 5′ DNA 末端共价结合

研究人员通过四种不同的方法验证了 SPO11 与 DNA 断裂处的共价结合。在电泳前，如果不使用蛋白酶 K 去除蛋白质，线性切割产物就检测不到，反而会因为共价结合的变性 SPO11 蛋白而变成一条模糊的条带；用酚 - 氯仿提取时，野生型 SPO11 存在时，在有机相中能检测到切割的 DNA，而 Y137F/Y138F 双突变体则检测不到；SPO11 切割产物能够抵抗 5′ - 3′核酸外切酶的降解，而 EcoRI 消化产生的线性产物则会被降解；用 3′荧光标记的底物进行切割反应时，能检测到比 MBP - SPO11 电泳迁移率略低的荧光信号，而 5′标记的底物则检测不到，且 Y137F/Y138F 突变体也检测不到。这些结果都表明，切割后 SPO11 会与 5′断裂的 DNA 链共价结合，就像给 DNA 断裂处贴上了一个特殊的 “标签”。

切割位点和底物偏好

研究人员用 5′标记的 80 - bp 双链进行切割反应，发现 SPO11 产生的切割位点具有偏好性，会形成特定长度的产物，且大多数偏好的切割位点在相对于二分体轴的 - 3 位置有一个鸟苷，这说明底物的碱基组成会影响 SPO11 的活性。通过对标准质粒切割反应产物的分析，发现切割位点在质粒上的分布是非随机的，偏好的切割位点对应着预测的 DNA 可弯曲性峰值。用含有高度可弯曲的 Widom 601 序列的质粒进行实验，发现该序列能产生 DNA 切割热点，但预测的可弯曲性峰值并不完全与偏好的切割位点一致，这表明 DNA 可弯曲性只是影响 SPO11 切割位点选择的因素之一。此外，超螺旋质粒比缺口质粒更容易被切割，含有 Widom 601 序列的超螺旋质粒与不含该序列的超螺旋质粒切割速率相同，而线性质粒中 Widom 序列的存在会加速切割，这说明 DNA 的拓扑结构也会影响 SPO11 的切割活性，就好像不同的 DNA 结构是不同的 “赛道”，SPO11 在不同 “赛道” 上的 “奔跑速度” 不一样。

切割需要杂合活性位点

所有 II 型拓扑异构酶（包括 SPO11）都被认为是利用两个亚基界面处的复合活性位点切割 DNA。研究人员通过诱变证实 Y138 是小鼠 SPO11 中的催化酪氨酸。当把两个催化失活的突变体 Y137F/Y138F 和 E224A 混合进行切割反应时，形成了缺口产物，这表明催化需要两个 SPO11 亚基协同作用来组装杂合活性位点，就像一把锁需要两把钥匙同时插入才能打开。

二聚化控制 DNA 切割

通过尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC - MALS）分析，发现纯化的 SPO11 主要以单体形式存在于溶液中，这就解释了其内在活性较低的原因。实验表明，增加 DNA 浓度会抑制切割，因为降低质粒占有率会降低 SPO11 二聚化的可能性。而且，SPO11 单体能有效结合 DNA，当达到一定阈值时，单体在底物上相遇才能进行切割，这就好比是两个小伙伴在特定的地点相遇才能一起完成任务。

SPO11 可以重新连接单链缺口

在一些反应中，研究人员观察到了额外的条带，经分析这些条带是质粒拓扑异构体，这表明 SPO11 有时可以重新连接断裂的 DNA 链。最有可能的情况是，当催化在单链断裂处停滞时，两个亚基分离，导致 DNA 围绕完整的磷酸二酯键旋转，然后二聚体界面重新组装，为反应逆转和 SPO11 从底物上释放提供了机会，就像是拉链拉到一半卡住了，调整后又可以继续拉上。

SPO11 - TOP6BL 复合物

小鼠 SPO11 与 TOP6BL 亚基形成复合物，研究人员利用 AlphaFold 3 对其进行建模，发现该复合物与弯曲的 DNA 底物结合，活性位点残基准备进行切割。通过 SEC - MALS 分析，证实了 SPO11 - TOP6BL 形成 1:1 的复合物。质粒切割实验表明，SPO11 和 SPO11 - TOP6BL 复合物的活性相似，但受反应条件影响。凝胶迁移分析发现，SPO11 - TOP6BL 复合物能有效结合 DNA，而 SPO11 单独则不能，这表明 TOP6BL 影响了 SPO11 的 DNA 结合特性，就像给 SPO11 装上了一个特殊的 “导航仪”，帮助它更好地找到 DNA 并结合。

综合这些研究结果，研究人员成功在体外重建了减数分裂 DNA DSB 的形成过程，揭示了 SPO11 切割反应的诸多特征。他们发现 SPO11 切割位点的选择受到序列、DNA 可弯曲性和拓扑结构的影响，并且 SPO11 在单链断裂中间体时能够重新连接断裂的链。SPO11 的切割受到其单体状态的控制，在 DNA 底物上二聚化后才能进行切割。这些发现为理解减数分裂 DNA DSB 形成的机制和调控提供了重要的框架，就像为细胞减数分裂的研究搭建了一个坚固的 “脚手架”。

在讨论部分，研究人员进一步阐述了这些发现的意义。虽然 SPO11 在体外可以独立切割 DNA，但在体内可能依赖辅助因子，因为其弱的二聚体界面需要通过其他方式达到二聚化的临界阈值。他们推测 SPO11 - TOP6BL 复合物在体内可能通过在 RMMI 凝聚物中的分区来实现二聚化，从而精确控制 DSB 的形成时间和空间。DNA 序列和拓扑结构对 SPO11 切割的影响，也有助于解释小鼠体内 DSB 的精细分布。此外，SPO11 的单链切割和重新连接活性，以及 DNA 切割的可逆性，都为深入理解减数分裂重组的过程提供了新的视角。这项研究就像一颗璀璨的星星，照亮了减数分裂重组机制研究的道路，为后续的相关研究奠定了坚实的基础，让我们对生命的奥秘有了更深入的认识。