解锁结直肠癌 “根源” 密码：调控 miRNA-15a 重塑癌症起始细胞命运与免疫防线

为解决结直肠癌（CRC）治疗耐药问题，卡塔尔 Sidra Medicine 的研究人员对 CRC 起始细胞（CICs）展开研究。结果发现调节 miRNA-15a 可抑制 CICs 肿瘤特性并增强免疫反应。该研究为 CRC 治疗提供新思路，值得科研读者一读。

　　

在当今的医学领域，结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）可是个让人头疼的 “大反派”。它是全球第三大常见癌症，每年约有 50 万人因它失去生命。尽管各种标准治疗方案、靶向疗法和免疫疗法不断涌现，让患者的总体生存率有所提高，但仍有相当一部分患者对这些治疗手段产生抵抗，或者在治疗过程中逐渐出现耐药性。

在肿瘤这个 “小社会” 里，有一小群特殊的 “成员”—— 癌症起始细胞（Cancer initiating cells，CICs） ，也叫癌症干细胞（Cancer stem cells，CSCs）。它们就像肿瘤里的 “种子”，拥有自我更新的神奇能力，能让肿瘤不断生长、复发，还对常规治疗，包括免疫治疗，有着很强的抵抗力。CICs 表达多种标记物，比如 CD133、CD24 等，但这些标记物很多也存在于正常细胞中，这使得它们的身份难以确定，也体现了肿瘤细胞的高度异质性。

癌症免疫疗法在多种癌症治疗中都展现出了显著疗效，T 细胞在其中起着关键作用，它能识别肿瘤细胞表面由人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）呈递的肿瘤抗原肽 。可狡猾的肿瘤细胞总有办法逃脱免疫反应，比如降低 HLA 或抗原加工机制（Antigen processing machinery，APM）分子的表达 。之前就有研究发现，从结直肠癌等实体瘤中分离出来的 CICs 免疫原性较差，HLA 和 APM 分子的表达水平不理想。此外，CICs 还会表达白细胞介素 4（Interleukin 4，IL-4）和免疫检查点分子，帮助它们躲避免疫系统的 “追捕”。

面对这些难题，卡塔尔 Sidra Medicine 的 Issam Tout 等人决心 “披荆斩棘”，探索新的治疗策略。他们在《Journal of Translational Medicine》期刊上发表了题为 “The integrative genomic and functional immunological analyses of colorectal cancer initiating cells to modulate stemness properties and the susceptibility to immune responses” 的论文 。研究发现，调节 CICs 中的 miRNA-15a 不仅能抑制肿瘤的发生发展，还能通过上调抗原呈递、减少免疫检查点分子，让免疫系统更容易发现并攻击肿瘤细胞。而且，将 miRNA-15a 调节与免疫调节药物或表观遗传疗法相结合，能进一步增强这种效果，有望克服结直肠癌的治疗耐药问题，改善患者的治疗效果。

为了开展这项研究，研究人员使用了多种关键技术方法。他们对 CICs 和分化的肿瘤细胞系进行了多组学分析，包括 DNA 甲基化分析、总 RNA 测序和微小 RNA（MicroRNA，miRNA）表达谱分析 ，以此来全面了解两种细胞在基因层面的差异。同时，进行功能免疫学实验，比如混合淋巴细胞肿瘤细胞培养（Mixed lymphocyte tumor cell cultures，MLTCs），观察 T 细胞对肿瘤细胞的免疫反应；还利用斑马鱼异种移植模型，在活体动物身上研究肿瘤细胞的生长和迁移情况 。

下面我们来看看研究人员都取得了哪些成果。

1. CRC-CICs 与肿瘤细胞系的多组学特征：通过对 CRC-CICs 和 FBS 肿瘤细胞系进行全面的基因组分析，研究人员发现两者在基因表达、DNA 甲基化和 miRNA 表达方面都存在显著差异。基因表达分析显示，CICs 中有 1187 个基因表达与 FBS 肿瘤细胞不同，其中 132 个基因差异显著 。这些差异基因涉及多个重要的分子通路，如细胞骨架与迁移、缺氧诱导因子 1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信号通路、果糖和甘露糖代谢等。DNA 甲基化分析发现了 3529 个差异甲基化位点，涉及 79 个差异甲基化基因和 31 个差异甲基化启动子 。这些甲基化差异与多种生物学过程相关，包括动物器官发育、免疫系统调节等。miRNA 表达谱分析则鉴定出了 57 种在 CICs 和 FBS 肿瘤细胞中差异表达的 miRNA 。其中，miRNA-15a 和 miRNA-196a 等在 CICs 中表达上调，且它们可能靶向由低甲基化基因和启动子转录的 mRNA。
2. miRNA 在 CICs 中的功能验证：研究人员通过 qRT-PCR 技术验证了 miRNA 在 CICs 和 FBS 肿瘤细胞中的表达情况，发现除了 miR-4461，大多数 miRNA 在 CICs 中的表达都高于 FBS 肿瘤细胞，其中 miRNA-15a 和 miRNA-196a 的上调具有统计学意义 。接着，他们对这两种 miRNA 进行功能验证，发现转染 miRNA-15a 和 miRNA-196a 模拟物后，能显著下调 CICs 中与上皮 - 间质转化（Epithelial - mesenchymal transition，EMT）和 CIC 表型相关的靶基因表达，如 CRKL、SMAD3 等 ；而抑制这两种 miRNA 则会导致这些靶基因表达上调。
3. CICs 与分化细胞对免疫调节和药物的不同反应：研究人员测试了 IFN-γ、5-aza、RG108、Vorinostat 和 Butyrate 等免疫调节和表观遗传药物对 CICs 和 FBS 肿瘤细胞中 MHC I 类、II 类和 APM 分子表达的影响 。结果发现，IFN-γ 能显著增加 CICs 中 HLA - I 类、II 类和 ICAM - 1 的表达，但对 FBS 肿瘤细胞没有影响；5-aza 和 RG108 对 HLA 和 APM 分子表达的提升作用不明显；Vorinostat 和 Butyrate 能增加 CICs 中部分相关分子的表达 。相比之下，转染 miRNA-15a 模拟物能更有效地提高 CICs 中 HLA - I 和 Calnexin 的表达，对恢复 CICs 的免疫原性效果更好。
4. miRNA 调节和药物处理对 CICs 基因程序的影响：研究人员分析了不同处理条件下 CICs 和 FBS 肿瘤细胞系的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs） 。结果显示，miRNA-15a 或 miRNA-196a 模拟物处理能使 CICs 中参与肿瘤抑制的基因表达上调，同时下调与肿瘤进展相关的基因，如 lncRNA SOX2-OT 。此外，表观遗传药物处理也能调节相关基因的表达，与 miRNA 调节起到互补作用。
5. miRNA 调节和药物处理增强 CICs 对 T 细胞的敏感性：研究人员将 PBMCs 与经过不同处理的 CICs 进行共培养，通过 EliSpot 测定 T 细胞的抗肿瘤反应 。结果发现，单独使用 CICs 很难诱导出抗 CIC 特异性 T 淋巴细胞，但经过 IFN-γ、HDACi（Vorinostat 或 Butyrate）或 miRNA-15a 模拟物处理后，CICs 能激活 T 细胞，产生更强的抗肿瘤反应 。其中，miRNA-15a 模拟物与 IFN-γ 和 1-MT 联合处理效果最佳，能诱导出针对 CICs 的高效 HLA I 类和 II 类介导的 T 细胞反应 。
6. 与 CRC 细胞共培养的 T 细胞表型特征：研究人员对与 CRC 细胞共培养的 T 细胞进行表型分析，发现不同处理条件下 T 细胞的亚群分布和功能状态存在差异 。比如，用 Vorinostat、5-aza 或 Butyrate 处理 CICs 后，与之共培养的 T 细胞中中央记忆 T 细胞和 CD279?CD272?、TIM-3?CTLA-4?等亚群富集，且抗肿瘤反应增强 。用 miRNA-15a 模拟物处理 CICs 后，能诱导出由干细胞记忆和效应记忆 T 细胞组成的肿瘤特异性 T 细胞反应。
7. miRNA 对 CICs 表型的调节作用：研究人员检测了 CICs 中与干性相关的标记物以及免疫检查点分子的表达，发现 miRNA-15a 和 miRNA-196a 模拟物能降低 CICs 中免疫检查点分子（如 PD-L1、PD-L2 和 CTLA-4）和免疫调节分子 IL-4 的表达 。此外，这两种 miRNA 还能抑制 CICs 和 FBS 肿瘤细胞的增殖能力，且在 CICs 中的作用更明显。
8. miRNA-15a 和 miRNA-196a 对体内肿瘤形成和迁移的调节：研究人员利用斑马鱼异种移植模型，发现上调 miRNA-15a 和 miRNA-196a 能显著抑制 CICs 和 FBS 肿瘤细胞在体内的迁移和肿瘤形成能力 。而且，miRNA 调节与 Butyrate 联合处理能进一步增强这种抑制效果。

综合上述研究结果，研究人员发现 miRNA-15a 在调节 CICs 的肿瘤发生和免疫原性方面起着关键作用。它不仅能抑制 CICs 的肿瘤形成、迁移和增殖能力，还能通过上调 HLA 和 APM 分子的表达，增强 CICs 对免疫系统的可见性，同时减少免疫检查点分子和免疫抑制细胞因子的表达，从而增强抗肿瘤免疫反应 。将 miRNA-15a 调节与免疫调节药物或表观遗传疗法相结合，能进一步放大这些效果，诱导出更强的肿瘤特异性免疫反应 。

这项研究意义重大。它首次对大量原发性 CICs 和分化的肿瘤细胞系进行了综合多组学分析，并在体外进行了功能验证，为理解 CICs 的生物学特性提供了全面的视角 。研究结果为克服结直肠癌的治疗耐药问题提供了新的策略，即通过调节 miRNA-15a 的表达，有可能恢复肿瘤细胞对 T 细胞介导的免疫反应的敏感性，抑制肿瘤的生长和侵袭 。尽管这些发现还需要进一步的转化研究，但为未来结直肠癌的治疗开辟了新的方向，有望改善患者的预后，给众多结直肠癌患者带来新的希望。