多囊卵巢综合征患者卵泡液外泌体 miRNA：卵子发育 “困境” 的 “解谜钥匙”？

为探究 PCOS 患者卵母细胞质量差的分子机制，华中科技大学同济医学院附属同济医院的研究人员开展卵泡液细胞外囊泡来源 miRNA 的研究。结果发现关键 miRNA 影响卵母细胞发育，该研究为理解 PCOS 病理提供新视角，值得科研读者一读。

　　

在女性的生殖健康领域，多囊卵巢综合征（PCOS）就像一个 “捣乱分子”，给众多育龄女性带来了困扰。PCOS 是一种常见的生殖障碍疾病，它有几个很明显的特征：雄激素过多，这会让女性出现多毛、痤疮等男性化的表现；排卵功能也不正常，卵子要么不按时排出，要么干脆不排；卵巢还会长出许多小囊肿 ，变成多囊样。全球大约有 20% 的育龄女性都受到它的影响，在导致女性不孕的原因里，PCOS 占据着重要位置。

虽然 PCOS 很常见，但诊断它却不是一件容易的事，因为它的临床表现各种各样。目前，大家比较认可的是鹿特丹诊断标准，只要符合雄激素过多、排卵异常、多囊卵巢形态这三条里的两条，就可以诊断为 PCOS。除了这些，患者还常常伴有月经不调、肥胖、胰岛素抵抗等问题。

对于 PCOS 患者来说，卵泡发育异常是个大问题，这会导致她们的卵子发育能力比较差。就算成功受精，胚胎的发育情况也不理想，怀孕后的结局往往不太好。很多因素都在 “捣鬼”，比如雄激素过多、胰岛素水平过高，还有一些旁分泌分子的调节失常，它们把卵泡周围的微环境搅得一团糟，进一步阻碍了卵子的成熟。可是，卵子发育不好背后的机制却一直没有完全弄清楚。

卵泡液（FF）是成熟卵泡里的一种液体，它就像是一个 “信息交流站”，让卵子、颗粒细胞（GCs）和周围其他细胞能互相 “沟通”。卵泡液里有蛋白质、类固醇、代谢物等，这些物质对卵泡的正常生长和卵子的成熟起着重要作用。最近，卵泡液里的外泌体等细胞外囊泡（EVs）引起了科学家们的关注，这些小小的囊泡就像 “快递员”，带着关键的分子货物，可能在类固醇生成和卵泡发育过程中发挥重要作用。

卵泡液来源的细胞外囊泡（FF-EVs）能把微小核糖核酸（miRNAs）、环状核糖核酸（circRNAs）、长链非编码核糖核酸（lncRNAs）和蛋白质运输到受体细胞，影响卵泡发育和卵子成熟相关的信号通路。之前有研究发现，PCOS 患者卵泡液里的 EVs 会干扰卵子的线粒体和纺锤体，通过氧化应激阻碍卵子成熟，可具体的分子机制还是个谜。而且，虽然有研究表明 PCOS 患者和正常女性卵泡液里的 miRNA 图谱不一样，但这些 miRNA 在 PCOS 患者卵子发育异常过程中到底扮演着什么角色，还不清楚。

为了弄清楚这些问题，华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心的研究人员在《Journal of Ovarian Research》期刊上发表了一篇名为 “Correlation between the follicular fluid extracellular-vesicle-derived microRNAs and signaling disturbance in the oocytes of women with polycystic ovary syndrome” 的论文。研究人员发现了几个关键的 miRNA，像 hsa-miR-93-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-625-5p 和 hsa-miR-17-5p，它们可能会影响卵子的发育能力。hsa-miR-93-3p 和 hsa-miR-152-3p 水平升高，hsa-miR-625-5p 和 hsa-miR-17-5p 水平降低，可能和 PCOS 患者卵子成熟障碍有关，而且这些变化可能是通过干扰 PI3K/Akt 信号通路来实现的。这一发现对我们理解 PCOS 患者卵子质量差的机制有很大帮助，为后续寻找新的治疗方法提供了方向。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先，他们从公共数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）收集了数据，包括卵泡液来源的细胞外囊泡中 miRNA 的表达谱数据和卵子中的基因表达谱数据。然后，用生物信息学方法，比如使用 R 软件中的相关包进行数据预处理和分析，找出差异表达的 miRNA（DEmiRNAs）和基因（DEGs）。还通过 TargetScan 预测 DEmiRNAs 的靶基因，利用 Venn 图分析找出重叠基因，构建共表达网络、蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，并用京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体论（GO）进行富集分析。最后，招募了 PCOS 患者和对照女性，收集卵泡液样本，通过超速离心法分离 FF-EVs，用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）对 EVs 进行表征，还用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证关键 miRNA 的表达情况。

下面来看看具体的研究结果：

1. 鉴定 PCOS 患者和对照组 EVs 中差异表达的 miRNA

研究人员从 GSE157037 数据集里获取信息，这个数据集包含了 7 例 PCOS 患者和 8 例对照女性的卵泡液来源的细胞外囊泡样本。通过聚类分析和火山图，他们发现了 14 个差异表达的 miRNA。其中，有 5 个在 PCOS 患者中表达上调，比如 hsa-miR-93-3p、hsa-miR-152-3p 等；9 个表达下调，像 hsa-miR-17-5p、hsa-miR-625-5p 等。这就像是在众多 miRNA 里找到了一群 “特殊分子”，它们在 PCOS 患者和正常女性之间表现得很不一样。

2. PCOS 患者和对照组卵子中差异表达的基因（DEGs）

从 GSE155489 数据集分析得知，这里面有 6 例 PCOS 患者和 8 例对照女性的 GV 期卵子样本。经过分析，一共找到了 976 个差异表达基因，其中 635 个在 PCOS 患者中上调，341 个下调。对这些基因进行 GO 和 KEGG 富集分析后发现，它们主要富集在一些和蛋白质代谢、非编码 RNA 代谢、线粒体功能等相关的生物过程、细胞组分和分子功能里，还和泛素介导的蛋白水解、核质运输等信号通路有关。这就好比给这些基因找到了各自 “工作” 的 “小天地”，让研究人员知道它们大概在哪些方面发挥作用。

3. DEmiRNAs - DEGs 相互作用网络

为了弄清楚细胞外囊泡里的 DEmiRNAs 对卵子有什么影响，研究人员把 FF-EVs 里的 DEmiRNAs 和卵子里的 DEGs 进行联合分析。他们预测出 6270 个基因是上调 miRNA 的靶基因，在这些靶基因和下调的 DEGs 里找到了 15 个重叠基因。通过构建共表达网络，发现 hsa-miR-93-3p、hsa-miR-152-3p 和 hsa-miR-146b-5p 是关键的 miRNA（hub miRNAs） 。这些 hub miRNAs 能沉默一些和卵子发育相关的基因，比如表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）等。对这些重叠基因进行功能分析后发现，它们和受体介导的内吞作用、Ras 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K - Akt 信号通路等有关。同样，在下调 miRNA 的靶基因和上调的 DEGs 里找到了 93 个重叠基因，构建网络后发现 9 个关键的 miRNA，这些 miRNA 能沉默一些和卵巢功能相关的基因，它们也和 Ras 信号通路、PI3K - Akt 信号通路等有关。这就像发现了一张复杂的 “关系网”，miRNA 和基因之间相互影响，共同作用于卵子的发育过程。

4. 患者的临床特征

研究人员又招募了 5 例 PCOS 患者和 5 例对照女性。对比发现，两组在年龄、体重指数（BMI）、基础卵泡刺激素（bFSH）、雌二醇（E2）这些指标上没有明显差异。但是，PCOS 患者的窦卵泡数（AFC）和取卵数比对照女性要高。这就像是找到了 PCOS 患者和正常女性在临床特征上的一些 “小差别”，虽然不多，但也为研究提供了一些线索。

5. EVs 的表征

通过蛋白质免疫印迹法检测发现，PCOS 患者和对照女性的 EVs 都有像 flotillin - 1（Flot - 1）和 CD9 这样的蛋白标记物，但是没有内质网特异性蛋白 calnexin。用纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测发现，两组的 EVs 大小都在 100nm 左右，不过 PCOS 患者的外泌体含量比健康对照者要多一些。透射电子显微镜（TEM）观察到 EVs 呈现双层结构。这些结果让研究人员对 EVs 有了更直观的认识，知道它们长什么样、有什么特点。

6. qRT - PCR 验证 PCOS 患者和对照组 FF-EVs 中差异表达的 miRNA

研究人员用 qRT-PCR 对 12 个 miRNA 的表达进行验证，以 hsa-miR16-5p 作为内参。结果发现，和对照相比，PCOS 患者 FF-EVs 中的 hsa-miR-93-3p 和 hsa-miR-152-3p 明显升高，hsa-miR-625-5p 和 hsa - let - 7c - 3p 明显降低，其他 miRNA 没有显著差异。这就像是给之前生物信息学分析的结果找到了 “实锤” 证据，进一步证实了这些 miRNA 在 PCOS 患者和正常女性之间的表达差异。

最后来总结一下研究结论和讨论部分。在这项研究里，研究人员通过联合分析 FF-EVs 中的 DEmiRNAs 和卵子中的 DEGs，再结合 qRT-PCR 验证，确定了 hsa-miR-93-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-625-5p 和 hsa-miR-17-5p 是关键的 miRNA。KEGG 富集分析表明，hsa-miR-93-3p 和 hsa-miR-152-3p 升高，hsa-miR-625-5p 和 hsa-miR-17-5p 降低，可能会通过干扰 PI3K/Akt 信号通路，损害 PCOS 患者卵子的发育能力。

这个研究意义重大。以前的研究大多关注 miRNA 对颗粒细胞的影响，而这项研究创新性地分析了 FF-EVs 中的 miRNA 对卵子的直接作用，为理解 PCOS 患者卵子质量差的机制提供了新的视角。不过，研究也有一些不足的地方，比如样本量比较小，还需要扩大样本量进一步验证这些关键 miRNA 的作用。而且，像 hsa-miR-93-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-625-5p 和 hsa-miR-17-5p 这些关键 miRNA 影响卵子发育的具体机制，还需要更深入地研究。但不管怎么说，这项研究已经为后续探索 PCOS 的发病机制和治疗方法迈出了重要的一步，相信在未来，科学家们能在这个基础上取得更多的突破，为 PCOS 患者带来新的希望。