解析成簇原钙粘蛋白 γB4 原位组装结构，解锁神经发育关键机制

为解决 cPcdhs 在神经元布线中作用机制不明的问题，上海交通大学医学院的研究人员开展 cPcdh-γB4 原位组装研究。结果发现胞外和胞内结构域共同调节其组装。该研究为理解神经元发育提供关键线索，值得科研人员一读。

　　

上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌症系统医学国家重点实验室（State Key Laboratory of Systems Medicine for Cancer, Shanghai Cancer Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine）的研究人员 Ze Zhang、Fabao Chen 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Structural insights into the in situ assembly of clustered protocadherin γB4” 的论文。这项研究在神经发育领域意义重大，为深入理解神经元连接过程中细胞粘附分子的作用机制提供了关键信息，有助于揭示神经系统发育的奥秘，也为相关神经系统疾病的研究和治疗提供了潜在的理论基础。

摘要解读

在神经发育过程中，神经元需要通过特定的排斥相互作用（如自我避免和平铺）来构建复杂的神经网络，以确保网络的正确排列和功能。成簇原钙粘蛋白（clustered protocadherins，cPcdhs）作为介导这些过程的关键分子，属于钙粘蛋白超家族，在脊椎动物中为神经元赋予特定身份，进而调节神经元间的相互作用。过去，虽然对 cPcdhs 的结构和功能有了一定研究，但背后的机制仍未完全明晰。在这篇论文中，研究人员通过电子断层扫描技术研究了 cPcdh - γB4（cPcdhs 的 γ 亚家族成员之一）的原位组装情况。研究发现，全长 cPcdh - γB4 在粘附界面没有呈现出规则的组织形式；而缺失细胞内结构域的 cPcdh - γB4（γB4 - ΔIC）能在细胞间形成有序的之字形图案，且其顺式相互作用模式与胞外结构域的晶体堆积模式不同。研究人员还通过诱变确定了胞外结构域上对之字形图案形成可能重要的残基。此外，细胞内结构域的截断突变体显示出细胞膜间不同的组装模式，这表明细胞内结构域在 cPcdh - γB4 的膜间组织中起着关键作用。这些结果表明，胞外结构域和细胞内结构域共同调节 cPcdh - γB4 的原位组装，以实现同嗜性细胞粘附，为理解 cPcdhs 在神经元布线过程中的功能机制提供了重要线索。

研究背景

在神经发育这个神秘而复杂的过程中，神经元就像一群训练有素的 “建筑师”，它们需要构建出极为复杂的神经网络。在这个过程里，自我避免和平铺这两个 “施工准则” 至关重要。自我避免是指单个神经元的树突或轴突分支之间会相互排斥，就好像它们有自己独特的 “身份标识”，能识别出 “自己人” 和 “外人”，避免彼此过度靠近。平铺则是具有相同功能的不同神经元之间会相互避让，通过共享某些 “身份特征” 来合理地分配空间，就像拼图一样，每个神经元都找到自己合适的位置，共同构建出有序的神经网络结构。

在果蝇中，唐氏综合征细胞粘附分子 1（Down syndrome cell adhesion molecules 1，DSCAM1）和 DSCAM2 分别在自我避免和平铺过程中发挥着关键作用。而在脊椎动物中，成簇原钙粘蛋白（cPcdhs）则被认为是介导这两个过程的重要分子。cPcdhs 属于钙粘蛋白超家族，根据其成簇的基因组组织形式以及在不同物种中的广泛存在而得名。它包含 50 - 60 种异构体，其基因位于人类 5 号染色体或小鼠 18 号染色体上，紧密排列成三个串联簇，对应着 α、β 和 γ 三个亚家族。每个簇都含有 10 - 30 个可变外显子，这些可变外显子编码完整的胞外结构域（ectodomain，EC）、跨膜结构域（transmembrane domain，TM）和可变的细胞内结构域（variable intracellular domain，VIC）。γ 簇中的可变外显子还可进一步分为 A 型和 B 型；α 和 γ 簇还包含三个恒定外显子，编码所有 cPcdh 亚型中都保守的共同细胞内结构域（common intracellular domain，CIC），不过 β - cPcdhs 缺少这个簇特异性的 CIC。

为了实现自我避免和平铺，细胞粘附分子介导的细胞粘附是必不可少的。已有研究表明，表达相同 cPcdh 异构体集合的细胞会发生粘附，而组合中哪怕只有一个异构体不匹配，粘附就会消失。这种对异构体组合的高匹配要求意味着 50 - 60 种 cPcdh 异构体能够为数十亿神经元提供独特的身份标识。

过去几十年，虽然对 cPcdhs 的同嗜性结合进行了广泛研究，也知道其胞外结构域包含六个细胞外钙粘蛋白结构域（EC1 至 EC6），晶体学结果显示单体的 EC1 - 4 之间会发生反式同嗜性相互作用，EC5 - 6 可能介导顺式二聚体的形成，交替的反式和顺式相互作用可能会在膜间形成类似拉链的结构。但对于 cPcdhs 在细胞粘附界面的详细情况，以及细胞内结构域在粘附或自我避免中的具体作用，仍然存在许多未知，这也正是研究人员开展这项研究的重要原因。

研究方法

1. 制备 DNA 构建体：研究人员将全长小鼠 cPcdh - γB4（GenBank: AAI38702.1）的 cDNA 克隆到 pCMV 表达载体中，并在 C 末端融合 GFP 或 mCherry 标签，构建出 γB4 - FL。同时，通过对 γB4 - FL 进行缺失突变，得到 γB4 - ΔIC、γB4 - ΔVIC、γB4 - ΔCIC 等多种截断突变体。对于结构域替换突变体，利用同源重组技术，将 γB4 的 EC5 和 / 或 EC6 替换为 γB6 的相应结构域。此外，还通过定点诱变技术在 γB4 - ΔIC 上生成了 T451Q / V453S、Q484H / Y488S 等单突变或双突变体。所有构建体都经过 DNA 测序验证，确保实验的准确性。
2. 共聚焦显微镜观察：把 HEK293T 细胞培养在涂有聚赖氨酸的盖玻片上，利用 Lipofectamine 2000 试剂将质粒构建体转染到细胞中。转染 24 小时后，用 4% 多聚甲醛固定细胞，0.5% Triton - X 进行通透处理，再用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片。然后在 Leica TCS SP8 共聚焦显微镜下采集图像。在进行粘附形成统计时，将细胞培养在多孔板中并转染 γB4 构建体，24 小时后在荧光显微镜 ECLIPSE Ts2 下观察，统计相邻细胞对中出现高亮荧光界面的百分比。实验重复三次以上，每次观察五个视野，数据用 GraphPad Prism 9.0 进行分析。
3. 电镜样品制备：在蓝宝石圆盘上通过碳蒸发标记并涂上聚赖氨酸用于细胞培养。转染目标构建体 24 小时后，将蓝宝石圆盘转移到标本架上，用 25 - μm 深度的铝制样品杯覆盖，并填充十六烷。之后将标本放入 Wohlwend HPF Compact 2 高压冷冻仪进行高压冷冻（HPF）。冷冻后的标本转移到含有 0.1% 醋酸铀、0.6% 水和 1% 四氧化锇的丙酮溶液的冷冻管中，在液氮温度下进行冷冻置换。完成冷冻置换后，将细胞包埋在树脂块中固化，再用 Leica EM UC7 超薄切片机进行切片。将 100 nm 厚的超薄切片收集在涂有 Formvar 膜并蒸镀碳膜的铜网上，用 3% 醋酸铀在 4°C 染色 7 分钟，再用柠檬酸铅在室温下染色 3 分钟。最后将染色后的切片放在 120 kV 的 Tecnai T12 显微镜下成像。
4. 电子断层扫描：把超薄切片放在 FEI Tecnai G2 电子显微镜（120 kV）上，使用 Xplore3D 软件以 1.5° 的增量收集从 - 60° 到 60° 的单轴倾斜系列图像，像素大小为 1.71 ?。利用 EMAN2.9 软件进行断层图像重建，最终的断层图像进行分箱处理，得到像素大小为 6.86 ? 的图像。使用 Fiji 软件测量膜间距离并计算膜间密度直方图，通过 EMAN2.9 结合 IMOD 软件进行半自动分割。
5. 模型构建：利用 UCSF Chimera 软件将 γB4 晶体结构（PDB entry 6E6B）中的反式二聚体拟合到分割后的断层体积中。使用 Blender 软件构建 γB4 - ΔIC 和 γB4 - FL 的示意模型。

研究结果

1. 全长 γB4 在粘附界面未形成有序组装模式：γB4 胞外结构域的晶体结构显示，它可以通过 EC1 - 4 的交替反式相互作用和 EC5 - 6 的顺式相互作用形成拉链状图案，在脂质体模型系统中也观察到了类似现象。研究人员将融合了 GFP 标签的全长小鼠 γB4（γB4 - FL）转染到 HEK293 细胞中，通过共聚焦显微镜观察发现，γB4 在细胞 - 细胞接触区域积累，形成绿色荧光线。对转染细胞进行高压冷冻、冷冻置换和超薄切片后，在电镜下观察发现，相邻细胞膜之间有电子致密特征，但检查多个粘附界面（超过 10 个）后，并未发现有序的组装模式。即使旋转标本在不同视角下观察，以及进行电子断层扫描重建，都证实了粘附界面没有有序结构。通过对断层图像的半自动分割，虽然观察到一些可能对应 γB4 胞外结构域反式二聚体的密度体积，但用晶体结构对接的准确性较差。此外，γB4 - FL 介导的粘附界面膜间距离约为 34 nm，与基于 γB4 胞外结构域晶体堆积的组装模型预测的 38 nm 不同。这表明 γB4 - FL 在粘附界面的原位组织可能与晶体堆积不同。
2. 缺失细胞内结构域的 γB4 在粘附界面形成有序之字形图案：研究人员同时转染缺失细胞内结构域的 γB4（γB4 - ΔIC）到 HEK293 细胞中并制备标本。共聚焦显微镜图像显示，γB4 - ΔIC 也在粘附界面积累形成高亮绿色线。然而，电镜图像令人惊讶地发现，γB4 - ΔIC 在粘附界面的细胞膜之间形成了有序的之字形图案。由于电镜切片的切割角度不同，不同界面的图案可能会有所差异，但在不同倾斜角度下观察，都能在某些角度看到之字形图案，说明 γB4 - ΔIC 在界面稳定地组装成了有序结构。通过电子断层扫描重建，在断层图像中可以清晰看到之字形图案，γB4 - ΔIC 介导的粘附界面膜间距离约为 28 nm。构建 γB4 - ΔIC 的组装模型时发现，γB4 胞外结构域的反式二聚体与断层密度匹配较好，而晶体中的顺式二聚体需要将两个单体之间的角度从 15 度增加到 80 度才能拟合到断层图像中，这样会使膜间距离减小到 28 nm，与断层图像观察结果一致。根据断层图像生成的 3D 拟合模型显示，γB4 胞外结构域在细胞膜之间形成了与晶体堆积不同的有序之字形图案，反式相互作用得以保留，γB4 - ΔIC 阵列在粘附界面平行排列。
3. EC5 对 γB4 - ΔIC 之字形图案形成很重要：γB4 - ΔIC 在细胞膜间形成的之字形图案表明，在没有细胞内结构域的情况下，γB4 胞外结构域可以在膜环境中自组装成有序结构。在 γB4 的 EC 结构域中，EC1 - 4 参与反式二聚体相互作用，在 γB4 - ΔIC 的原位组装中得以保留；而 EC5 - 6 介导的顺式二聚体相互作用变化显著，暗示它们可能在之字形图案形成中起主要作用。研究人员构建了将 γB4 的 EC5 - 6 替换为 γB6 的 EC5 - 6 的嵌合分子，电镜数据显示，替换后之字形图案消失，证实了 EC5 - 6 在组装中的重要性。进一步构建分别替换 EC5 或 EC6 的嵌合分子，结果显示替换 EC5 会破坏之字形图案形成，而替换 EC6 对图案形成没有影响，说明 EC5 对 γB4 - ΔIC 的图案形成至关重要。为了确定 EC5 上对组装重要的残基，研究人员对 γB4 和 γB6 的 EC5 进行序列比对，发现除了 T451 - V453、Q484 - Y488、E497 和 H535 - S537 这四个区域外，序列同一性高达 87%。于是制作了四个突变体，包括 T451Q / V453S、Q484H / Y488S、E497K 和 H535Q / S537K，通过电镜观察发现，除了 E497K 突变体外，其他突变体在细胞界面仍保留了之字形图案，表明 EC5 上的 E497 可能在 γB4 - ΔIC 的有序组装中起重要作用。
4. γB4 - ΔIC 原位组装的顺式相互作用：断层模型拟合表明，晶体学顺式二聚体的角度从 15 度增加到 80 度。在晶体结构中，E497 位于 EC5 表面。随着顺式二聚体角度变化，E497 可能会靠近另一个单体 EC6 表面的带正电区域，这种静电相互作用可能有助于稳定之字形图案，也解释了 E497K 单突变会破坏之字形图案的原因。根据已发表数据，L585 和 V590 位于 γB4 胞外结构域晶体结构的顺式二聚体界面，对细胞粘附很重要。研究人员在 γB4 - ΔIC 上对这两个残基进行突变（L585A 和 V590G），荧光显微镜观察发现，转染这两个突变体的细胞几乎没有识别到粘附界面，这意味着这些残基可能对 γB4 - ΔIC 在细胞表面的组装也很重要。综合来看，晶体结构中的顺式二聚体界面可能像一个由疏水相互作用维持的 “铰链”，而 E497 可能通过电荷相互作用与相邻单体相互作用，稳定 γB4 - ΔIC 在粘附界面之字形图案中顺式二聚体的大开口角度。
5. 细胞内结构域调节 γB4 的原位组装：γB4 - FL 和 γB4 - ΔIC 的原位组装模式差异显著，这表明 γB4 的细胞内结构域参与调节其在粘附界面的组织。已有研究表明 cPcdhs 的细胞内结构域可以相互作用，影响 cPcdhs 胞外结构域的组装。研究人员共转染 γB4 - FL（融合 RFP）和 γB4 的细胞内结构域（包括 TM 和 IC，融合 GFP），共聚焦图像显示 IC 可以与 γB4 - FL 在界面共定位。进一步分别共转染 γB4 - FL（融合 RFP）与 VIC 或 CIC（包括 TM 和 VIC 或 CIC，融合 GFP），共聚焦图像也显示 VIC 和 CIC 都能与 γB4 - FL 共定位，证实了 γB4 的细胞内结构域在粘附过程中可以在细胞膜上相互作用。此外，共聚焦图像还显示，没有 TM 时，IC 单独分布在整个细胞，包括细胞核，这与已发表的 cPcdhs 细胞内结构域裂解片段具有核定位的研究结果一致，说明细胞内结构域之间的顺式相互作用可能不是很强，只有在细胞膜上时才会局部发生。为了进一步探究细胞内结构域对 γB4 原位组装的影响，研究人员生成了两个 IC 截断突变体 γB4 - ΔCIC 和 γB4 - ΔVIC，分别去除了 CIC 或 VIC。荧光显微镜显示这两个突变体都能介导转染细胞的粘附。电镜图像和断层扫描显示，它们在细胞膜之间没有形成有序组装，膜间距离约为 33 nm，与 γB4 - FL 相似。但两个突变体的膜间断层密度不同，γB4 - ΔVIC 在界面的分子似乎比 γB4 - ΔCIC 更多，且二者在界面的分子都比 γB4 - FL 多，这与之前细胞内结构域可能限制 cPcdhs 在细胞 - 细胞接触处积累的研究结果相符，表明部分缺失细胞内结构域可能会减少其对胞外结构域组织的影响，且 VIC 对组装的影响可能比 CIC 更大，这可能是因为 VIC 比 CIC 更靠近细胞膜。研究人员还评估了 γB4 - FL 和 IC 截断突变体介导的粘附形成效率，统计结果显示 γB4 - ΔIC 的粘附效率最高，说明之字形图案对胞外结构域更有利，细胞内结构域显著降低了粘附效率。删除 VIC 或 CIC 可以增加粘附形成，也可能部分恢复界面处胞外结构域的组装。进一步将 γB4 的 VIC 分为 VIC1、VIC2 和 VIC3 三个区域，制作每个区域的缺失突变体进行粘附实验，荧光图像显示 γB4 - ΔVIC2 形成粘附界面的效率最高，表明 VIC2 中的残基可能对调节组装形成很重要，这与之前该区域残基参与介导细胞内结构域相互作用和转运的研究结果一致。此外，通过 AlphaFold 进行的结构预测显示，cPcdhs 的细胞内结构域相当灵活，没有二级结构，其如何在原位调节分子组织仍有待进一步研究。

研究结论与讨论

细胞粘附分子，如钙粘蛋白和免疫球蛋白超家族（IgSF）粘附分子，在介导细胞 - 细胞接触中起着重要作用。过去几十年，通过 X 射线晶体学对这些分子的结构，尤其是胞外结构域进行了广泛研究。近年来，电