深度剖析肠道微生物组与类风湿关节炎因果关联及免疫细胞介导机制的前沿研究

为解决类风湿关节炎（RA）发病机制及治疗策略难题，贵州中医药大学研究生院研究人员开展肠道微生物群与 RA 关系研究。结果发现二者因果关联及免疫细胞的介导作用。该研究为 RA 防治提供新视角，值得科研人员一读。

　　

贵州中医药大学研究生院（Graduate School, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine）的研究人员在《Journal of Translational Medicine》期刊上发表了名为 “Investigating the causal relationship between the gut microbiome and rheumatoid arthritis: mediating effects of immune cells” 的论文。这篇论文在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）研究领域意义重大，它深入探索了肠道微生物群与 RA 之间的因果关系，为理解 RA 的发病机制以及开发新的治疗策略提供了关键线索。

研究背景

类风湿关节炎是一种复杂的自身免疫性炎症疾病，严重影响全球数百万人的生活质量。流行病学数据显示，类风湿关节炎在全球的发病率存在显著差异，女性比男性更易患病，患者的残疾率可超过 50%，且随着病程延长而增加。目前，治疗类风湿关节炎的方法多样，包括药物治疗、生物治疗和靶向治疗等，但这些治疗方法仍存在诸多局限，如只能缓解症状，无法阻止疾病进展，且生物治疗和靶向治疗费用高昂、存在潜在副作用。因此，深入研究类风湿关节炎的发病机制，寻找新的治疗策略迫在眉睫。

肠道微生态平衡与免疫力密切相关，肠道菌群能够影响免疫反应和细胞因子分泌。肠道黏膜作为保护屏障，可防止有害物质进入，同时肠道也是重要的免疫球蛋白和抗体分泌器官。研究发现，肠道菌群失调与多种疾病的发生有关，在类风湿关节炎的病因研究中，微生物感染是近年来的热点。例如，大肠杆菌、结核分枝杆菌等感染与类风湿关节炎的发展相关，患者关节中可检测到肠道细菌降解的 DNA 和细胞壁肽聚糖成分，且使用人类肠道细菌细胞壁可诱导实验动物患关节炎。此外，类风湿关节炎患者的肠道菌群存在特征性变化，有害菌增加，有益菌减少，这些变化可能引发免疫系统的不当激活，导致炎症物质生成增加，进而促使关节炎及其他风湿性疾病症状的出现。

在类风湿关节炎的发病过程中，滑膜炎症起着关键作用。它由先天和适应性免疫细胞的大量涌入介导，这些免疫细胞之间的复杂相互作用引发关节炎症。同时，滑膜新生血管形成、淋巴管生成不足和细胞凋亡抑制等因素持续驱动滑膜炎症。成纤维样滑膜细胞（fibroblast - like synoviocytes，FLS）大量增殖，并通过产生核因子 - κB 受体激活剂配体（receptor activator of nuclear factor - κB ligand，RANKL）促进破骨细胞分化，导致受累关节的骨破坏。此外，在类风湿关节炎患者的滑膜组织中，已鉴定出 18 种细胞群体，它们共同促进了炎症的起始和进展。研究还发现，不同免疫细胞在类风湿关节炎的发病过程中发挥着不同作用，如 CD11a、CD11b 在不同类型的树突状细胞（dendritic cells，DCs）中表达不同，Th1 细胞、Th2 细胞通过分泌细胞因子参与免疫反应，Th1/Th2 比例失衡与疾病活动度相关，中性粒细胞通过调节黏附分子和趋化因子表达促进炎症等。

基于以上背景，研究人员推测特定肠道微生物与类风湿关节炎之间存在因果关系，且某些免疫细胞可能在其中起介导作用。为验证这一假设，研究人员开展了此项研究，旨在通过孟德尔随机化（Mendelian Randomization，MR）分析来探究肠道微生物群与类风湿关节炎之间的因果关系，并进一步研究免疫细胞在这一关系中的介导作用。

研究方法

本研究严格遵循《Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology - Mendelian Randomization（STROBEMR）》声明中概述的协议。

研究采用孟德尔随机化分析方法，该方法利用遗传变异作为工具变量，相比传统观察性研究，受反向因果关系和混杂因素的影响较小，能为研究肠道微生物群在风湿性疾病中的潜在作用提供新视角。研究人员整合了来自 FinnGen、MiBioGen 数据库以及 Valeria Orrù 团队研究的全基因组关联研究（genome - wide association study，GWAS）数据，全面系统地研究肠道微生物群、免疫细胞和类风湿关节炎之间的关系。

在研究设计方面，首先进行双向单变量孟德尔随机化（univariable MR，UVMR）分析，以评估肠道微生物群与类风湿关节炎之间的关联，并排除反向因果关系的影响。接着，对与类风湿关节炎呈正相关的肠道微生物进行多变量孟德尔随机化（multivariable MR，MVMR）调整。随后，采用两步法研究与免疫细胞相关的肠道微生物群对类风湿关节炎风险的总体遗传预测影响。第一步，对与免疫细胞正相关的每种肠道微生物进行常规 UVMR 分析，确定 β1（p < 0.05）；第二步，使用识别出的阳性免疫细胞及其相关肠道微生物进行 MVMR 分析，计算 β2（p < 0.05）。为确保模型的稳健性，研究人员还进行了交叉验证，并考虑了替代建模方法。

研究中，类风湿关节炎数据来源于 FinnGen 数据库，该数据库将芬兰生物样本库的基因型信息与芬兰健康登记处的电子健康记录相结合，样本量大，有助于全面研究遗传变异与疾病进展的关系。肠道微生物群数据来自 MiBioGen 数据库，这是目前研究宿主 - 遗传 - 微生物组关联的最大资源之一，涵盖多个国家和不同种族背景的人群序列。免疫细胞的 GWAS 数据来自 Valeria Orrù 等人的研究，该研究分析了撒丁岛人的 731 种免疫细胞特征，明确了细胞亚型水平的遗传调控机制，为研究提供了关键数据支持。

在选择工具变量时，研究人员制定了严格标准。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为工具变量需满足三个条件：与暴露因素有显著关联；仅通过暴露因素影响结果；受混杂变量影响小，以减少连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）带来的偏差。具体而言，与肠道微生物群相关的工具变量需达到全基因组显著性水平（p < 1×10??），基于欧洲 1000 基因组计划进行 LD 分析，设定参数 R2 < 0.001 和 LD = 10,000 kb，通过 F 统计量评估遗传变异作为工具变量的可靠性，F 统计量低于 10 的工具变量被排除。在进行反向 MR 分析时，与类风湿关节炎相关的工具变量也需满足相应严格标准（p < 1×10??，R2 < 0.001，LD = 10,000 kb，排除 F 统计量低于 10 的变量）。

为保证数据质量，研究人员进行了严格的数据预处理，包括基因型检测、质量控制筛选和插补。在这一过程中，排除了低检出率、低次要等位基因频率以及不符合哈迪 - 温伯格平衡标准的变异。同时，通过连锁不平衡修剪和聚类方法，仔细选择独立的遗传变异作为工具变量，避免相关变异带来的潜在偏差。针对多效性，研究人员进行了全面的文献综述，识别并排除具有已知多效性影响的变异，还通过敏感性分析评估研究结果对潜在多效性偏差的稳健性。

统计分析主要使用 R 软件（版本 4.3.1），借助 “Two Sample MR”（版本 0.5.7）和 “Mendelian Randomization”（版本 0.9.0）等 R 包进行计算。通过计算 R2 统计量评估 SNP 对表型变异的解释比例，利用 F 统计量评估工具变量的强度，一般 F 统计量超过 10 被认为具有统计学意义，表明因果关系可能不受偏差影响。在 UVMR 分析中，首先使用逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）方法评估所有工具变量的有效性，通过 Cochran's Q 统计量评估工具变量之间的异质性，采用 MR - Egger、加权中位数（weighted median，WM）和 MR 多效性残差和异常值（MR pleiotropy residual sum and outlier，MR - PRESSO）等方法进行敏感性分析，以确保 IVW 结果的可靠性，减少工具变量带来的偏差。在两步中介分析和 MVMR 分析中，对与免疫细胞相关的工具变量也设定了严格标准（p < 1×10??，R2 < 0.1，连锁不平衡阈值为 500 kb，排除 F 统计量低于 10 的变量），并使用多变量逆方差加权技术评估所有工具变量的一致性。

研究结果

1. 肠道微生物群对类风湿关节炎的因果影响：通过孟德尔随机化分析，研究人员发现类风湿关节炎与多种微生物分类群存在显著关联。其中，MollicutesRF9.id.11579、unknownfamily.id.1000005471、unknowngenus.id.1000005472、RuminococcaceaeUCG002.id.11360 和 Butyricimonas.id.945 等与类风湿关节炎呈显著正相关，这表明这些微生物可能通过产生炎症介质、破坏关节组织或影响免疫系统，促进类风湿关节炎的发生和发展。而 Rikenellaceae.id.967、Lactobacillaceae.id.1836、Acidaminococcaceae.id.2166、Veillonella.id.2198、Prevotella9.id.11183、Prevotella7.id.11182、Paraprevotella.id.962 和 Sellimonas.id.14369 等与类风湿关节炎呈显著负相关，提示它们可能通过抑制炎症反应、保护关节组织或调节免疫系统，对类风湿关节炎起到保护作用。
2. 类风湿关节炎对肠道微生物群的因果影响：为排除反向因果关系，研究人员进行了 MR 分析。结果发现，类风湿关节炎与 Lachnospiraceae 家族（如 id 1987）、Ruminococcus1 属（id 11373）、Ruminococcaceae UCG009 属（id 11366）、Favonifractor 属（id 2059）和 Erysipelotrichaceae UCG003 属（id 11384）等微生物的相对丰度降低相关，同时与 Eubacterium fissicatenagroup（id 14373）的相对丰度增加有关。鉴于这些微生物与类风湿关节炎之间存在明确的因果关系，研究人员在后续分析中将其排除。
3. 肠道微生物群对类风湿关节炎因果影响的校正：在初步分析后，研究人员发现部分微生物分类群与类风湿关节炎的关联不显著。为进一步探究，他们采用多变量孟德尔随机化（MVMR）分析，结果显示，除了 family.unknownfamily.id.1000005471 和 genus.Butyricimonas.id.945 与类风湿关节炎呈显著负相关外，其他微生物分类群与类风湿关节炎无显著关联。随后，研究人员对这两个微生物分类群进行了进一步分析，通过漏斗图、留一法（leave - one - out）图和散点图等方法验证了结果的可靠性，表明研究结论不受孤立异常值影响，具有较高的精度和稳健性。
4. 肠道微生物群对免疫细胞的因果影响：研究人员利用 MR 分析中的逆方差加权方法，研究了有益肠道微生物与免疫细胞之间的因果关系。结果发现，Butyricimonas id. 945 属与多种免疫细胞表型存在显著负相关。具体表现为，它与 CD39 + 活化 CD4 调节性 T 细胞上 CD3 的表达降低、CD4 调节性 T 细胞上 CD28 的表达降低、CD39 + CD4 T 细胞上 CD3 的表达降低、CD39 + CD4 调节性 T 细胞上 CD25 的表达降低以及单核细胞上 CD39 水平的降低均有关，这些结果表明 Butyricimonas id. 945 属可能通过调节免疫细胞功能，影响类风湿关节炎的发病过程。
5. 免疫细胞对类风湿关节炎的因果影响：通过 MVMR 分析，研究人员发现 CD39 + 活化 CD4 调节性 T 细胞上的 CD3、CD39 + CD4 + T 细胞上的 CD3、CD4 调节性 T 细胞上的 CD28、CD39 + CD4 调节性 T 细胞上的 CD25 以及单核细胞上的 CD39 等免疫细胞标记物与类风湿关节炎均存在显著因果关系。而 Butyricimonas id. 945 属与类风湿关节炎之间未发现直接因果关联，这进一步支持了免疫细胞在肠道微生物群与类风湿关节炎之间的因果关系中起介导作用的观点。
6. 免疫细胞在肠道微生物群与类风湿关节炎关系中的介导作用：研究结果表明，Butyricimonas id. 945 属对类风湿关节炎存在显著总效应，且这一效应部分可由不同免疫细胞标记物介导。以 CD39 + 活化 CD4 调节性 T 细胞为例，其介导作用占总效应的 6.95%；CD39 + CD4 + T 细胞的介导效应比例为 6.83%；CD4 调节性 T 细胞上的 CD28 介导效应比例为 8.86%；CD39 + CD4 调节性 T 细胞上的 CD25 介导效应比例为 10.82%；单核细胞上的 CD39 介导效应比例为 8.36%。这表明免疫细胞在肠道微生物群与类风湿关节炎的关系中起着重要的介导作用。

研究结论与讨论

本研究通过孟德尔随机化分析，深入探讨了肠道微生物群与类风湿关节炎之间的因果关系，明确了免疫细胞在这一关系中的重要介导作用。研究发现，Butyricimonas id. 945 属可能通过调节特定免疫细胞的数量和功能，间接影响类风湿关节炎的发展。这一发现不仅加深了我们对类风湿关节炎病理生理学的理解，还为未来潜在的临床应用提供了新方向。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，尽管研究样本广泛，但样本量是否足以代表全人群仍有待探讨。其次，研究中使用的撒丁岛免疫细胞数据集可能存在种族相关的偏差，这使得研究结果在其他种族群体中的适用性存在不确定性。此外，虽然通过 MR 分析建立了关联，但缺乏细胞和动物模型水平的深入研究，限制了对这些关联背后生物学机制的确定。最后，研究仅聚焦于特定的微生物组，如 Butyricimonas 属，可能忽略了其他微生物在类风湿关节炎发病机制中的重要作用。

尽管存在这些局限性，本研究依然具有重要意义。它与先前的研究相互补充，进一步证实了肠道微生物群在类风湿关节炎发病机制中的潜在作用。研究中使用的孟德尔随机化分析方法，结合高质量的 GWAS 数据集，确保了研究结果的可靠性和可重复性。未来的研究应进一步探究肠道微生物群、免疫细胞和类风湿关节炎之间相互作用的具体机制，在更多样化的人群中验证研究结果，并开发基于调节肠道微生物群的新疗法，以改善类风湿关节炎患者的生活质量，恢复肠道微生物生态平衡，为类风湿关节炎的预防和治疗开辟新的道路。