CXCL7 通过激活 ERK/NFATc1 通路促进炎性关节炎骨破坏机制及潜在治疗靶点研究

为解决类风湿关节炎（RA）治疗难题，北京大学第三医院研究人员开展 CXCL7 在 RA 中作用的研究。发现 CXCL7 可加重骨破坏，靶向它能缓解病情。该研究为 RA 治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

北京大学第三医院（Peking University Third Hospital）的研究人员在《Arthritis Research & Therapy》期刊上发表了题为 “CXCL7 enhances RANKL-induced osteoclastogenesis via the activation of ERK/NFATc1 signaling pathway in inflammatory arthritis” 的论文。这项研究对于类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的发病机制探究以及新型治疗靶点的确定具有重要意义，有望为改善 RA 患者的治疗现状提供新的思路和方向。

研究背景

类风湿关节炎是一种令人头疼的自身免疫性疾病，它以慢性滑膜炎和骨破坏为主要特征，就像一个隐藏在身体里的 “破坏者”，悄无声息地侵蚀着关节，最终导致关节畸形和残疾，给患者的生活带来极大的痛苦，也给家庭和社会造成了沉重的负担。到目前为止，类风湿关节炎的确切发病机制还没有完全弄清楚。过去二十年，生物制剂、小分子靶向药物的出现，以及 “达标治疗” 策略的临床应用，让部分患者的病情得到了改善，但仍有一部分患者对现有治疗反应不佳，病情难以控制。所以，进一步探索类风湿关节炎的发病机制，寻找新的治疗靶点，成了医学领域亟待解决的重要问题。

在类风湿关节炎的研究中，抗瓜氨酸化蛋白 / 肽自身抗体（Anti-citrulinated protein/peptide autoantibodies，ACPA）备受关注。它是类风湿关节炎的一个特异性指标，可以用来辅助疾病的诊断和预后评估。根据 ACPA 的有无，类风湿关节炎可以分为 ACPA 阳性（ACPA+）和 ACPA 阴性（ACPA-）两种亚型。ACPA + 的患者通常关节损伤和影像学病变更严重。研究发现，ACPA + 和 ACPA - 的类风湿关节炎患者在易感基因位点上有明显差异，而且外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的基因表达谱也不同。之前有研究表明，趋化因子如 C-X-C 基序趋化因子配体 2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）在类风湿关节炎的骨破坏中发挥了作用，而 C-X-C 基序趋化因子配体 7（C-X-C motif chemokine ligand 7，CXCL7）在类风湿关节炎发病机制中的作用还需要进一步明确。

CXCL7 属于 CXC 趋化因子家族，血小板、巨核细胞、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等都能产生它。它参与了很多重要的生理过程，比如血管生成和恶性肿瘤的生物学行为。早在 2009 年，就有研究发现 CXCL7 能增加骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage，BMM）生成的破骨细胞数量，在体外使用 CXCL7 中和抗体能减少破骨细胞的数量。在人类多发性骨髓瘤中，CXCL7 还被发现是基质金属蛋白酶 - 13（MMP - 13）的底物和破骨细胞生成的调节因子。基于这些研究，研究人员推测 CXCL7 可能会通过影响破骨细胞生成，加重类风湿关节炎的骨破坏，这一推测为后续的研究指明了方向。

研究方法

1. 参与者：研究人员从北京大学第三医院风湿免疫科 2018 年至 2021 年收治的患者中，挑选了 132 例符合 2010 年欧洲抗风湿病联盟 / 美国风湿病学会分类标准的类风湿关节炎患者。为了保证研究结果的准确性，他们把怀孕、感染、患有其他自身免疫性疾病、肿瘤、心力衰竭或其他器官功能障碍的患者都排除在外。同时，还招募了 68 名健康人作为对照。所有涉及人体标本的操作，都在患者知情同意的情况下进行，并且整个研究符合赫尔辛基宣言的要求，还得到了北京大学第三医院伦理委员会的批准。
2. 细胞培养：从类风湿关节炎患者的血液中，研究人员用 Ficoll-Paque Plus 分离出 PBMCs，再通过磁珠分选技术筛选出 CD14 + 单核细胞，把它们放在含有 10% 热灭活胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中培养。在培养过程中，加入巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、核因子 κB 受体活化因子配体（Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）和不同浓度的 CXCL7，诱导破骨细胞分化。此外，还对 RAW264.7 巨噬细胞进行了类似的培养处理。
3. 实验检测
   • 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：用 ELISA 试剂盒检测人和小鼠血浆中 CXCL7 的水平，就像给 CXCL7 做了一个 “精准体检”，能准确地知道它在血浆中的含量。
   • 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphates，TRAP）染色：按照试剂盒的说明进行 TRAP 染色，在显微镜下数出含有三个或更多细胞核的 TRAP 阳性细胞数量，以此来判断破骨细胞的生成情况。
   • F - 肌动蛋白环免疫荧光：通过固定细胞，用 FITC 标记的抗肌动蛋白抗体孵育，再用 DAPI 染色，在显微镜下观察 F - 肌动蛋白环的形成，这有助于了解破骨细胞的功能状态。
   • 骨吸收试验：把 CD14 + 单核细胞接种在骨切片上，培养一段时间后，对骨切片进行处理，在扫描电子显微镜下观察吸收坑的情况，并用 Image J 软件测量吸收坑的面积，从而评估破骨细胞的骨吸收能力。
   • 定量聚合酶链反应（Quantitative PCR）：用 TRIzol 试剂提取总 RNA，再逆转录合成单链 cDNA，然后进行 RT-PCR 反应，检测相关基因的表达水平，看看这些基因在类风湿关节炎的发生发展过程中起到了什么作用。
   • 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）：裂解 RAW264.7 细胞，提取总蛋白，进行电泳和转膜，用特异性抗体孵育，再通过化学发光显影和 Image J 软件分析，研究相关信号通路的变化。
   
   
4. 动物实验：选用 6 - 8 周龄的 DBA/1 雄性小鼠，构建胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis，CIA）模型。给小鼠皮下注射牛 II 型胶原和弗氏完全佐剂，21 天后再注射牛 II 型胶原和弗氏不完全佐剂。在二次免疫后的第 3、6、9、12、15 和 18 天，分别给小鼠腹腔注射同型抗体和 CXCL7 中和抗体。之后，对小鼠进行关节炎评分、组织学评估和 Micro-CT 扫描，观察关节炎症和骨破坏的情况。
5. 统计分析：研究人员用 Spearman 相关性分析、Mann-Whitney 检验和单因素方差分析等方法对数据进行处理，判断不同组之间的差异是否具有统计学意义，只有当 p < 0.05 时，才认为差异显著。

研究结果

1. RA 患者血浆 CXCL7 浓度升高且与疾病活动度正相关：研究人员检测了 97 例 ACPA + RA 患者、35 例 ACPA - RA 患者和 68 名健康对照者血浆中 CXCL7 的浓度。结果发现，RA 患者血浆 CXCL7 的中位水平明显高于健康对照者，ACPA + RA 患者的血浆 CXCL7 浓度又显著高于 ACPA - RA 患者。而且，有骨侵蚀的 RA 患者血浆 CXCL7 浓度比没有骨侵蚀的患者更高。进一步分析发现，CXCL7 浓度与疾病活动度评分（DAS28）、红细胞沉降率（ESR）和 C 反应蛋白（CRP）都呈正相关，但与类风湿因子（RF）滴度没有明显相关性。这就像是发现了一个 “危险信号”，血浆 CXCL7 浓度越高，类风湿关节炎的病情可能越严重，骨破坏的风险也越大。
2. CXCL7 促进 RA 患者 CD14 + 单核细胞的破骨细胞生成和骨吸收：通过 TRAP 染色发现，CXCL7（50 ng/ml）能增强 RANKL 诱导的 RA 患者 CD14 + 单核细胞的破骨细胞生成。免疫荧光显微镜观察到，CXCL7 能促进 F - 肌动蛋白环的形成。骨吸收试验也表明，CXCL7 处理后的骨切片吸收面积增加。此外，CXCL7 还能提高 RANK、组织蛋白酶 K（cathepsin K）和 TRAP 的转录水平。这一系列结果说明，CXCL7 就像一个 “帮凶”，在类风湿关节炎患者体内，帮助破骨细胞变得更加活跃，加速了骨破坏的进程。
3. Cxcl7 通过 ERK/NFATc1 信号通路促进破骨细胞生成：研究人员在 RAW264.7 细胞中进行实验，发现 Cxcl7（50 ng/mL）虽然没有增加破骨细胞的总数，但能显著增加每个破骨细胞的细胞核数量。同时，Cxcl7 还能提高 RANK、cathepsin K 和 TRAP 的转录水平。进一步研究信号通路发现，Cxcl7 能显著增加 RAW264.7 细胞中 NFATc1 的表达，在 10 分钟和 15 分钟时显著增加 ERK1/2 的磷酸化水平，但对 p65 的磷酸化没有影响。这表明，Cxcl7 是通过激活 ERK/NFATc1 信号通路，来促进破骨细胞生成的，为揭示类风湿关节炎骨破坏的机制提供了关键线索。
4. CIA 小鼠外周血中 Cxcl7 表达的动态变化：检测 CIA 小鼠和对照组小鼠二次免疫后 0、3、7、14 和 21 天血浆中 Cxcl7 的水平，发现 CIA 小鼠血浆 Cxcl7 水平在二次免疫后显著升高，在第 7 天达到峰值。这就像是 CIA 小鼠体内的一个 “定时炸弹”，Cxcl7 水平的异常升高，可能在关节炎症和骨破坏的过程中起到了重要作用。
5. Cxcl7 中和抗体改善 CIA 小鼠的炎症性关节炎和破骨细胞形成：给 CIA 小鼠注射 Cxcl7 中和抗体后，发现从二次免疫后的第 16 天到 21 天，Cxcl7 中和抗体组的关节炎评分明显低于 CIA 组。对小鼠踝关节进行组织学染色发现，Cxcl7 中和抗体组的炎症细胞浸润和滑膜组织增生明显减轻，破骨细胞数量也显著减少。这说明 Cxcl7 中和抗体就像一个 “救星”，能有效地缓解 CIA 小鼠的关节炎症，减少破骨细胞的生成，对类风湿关节炎的治疗有潜在的应用价值。
6. Cxcl7 中和抗体减轻 CIA 小鼠的骨破坏：通过 Micro-CT 扫描和三维重建评估小鼠的骨损伤程度，发现 CIA 小鼠出现了皮质骨缺损和骨丢失，而 Cxcl7 中和抗体组的这些情况明显减轻。具体来说，Cxcl7 中和抗体组的骨体积分数（BV/TV）显著增加，骨表面积与骨体积比（Bs/Bv）降低，骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）增加。这进一步证明了 Cxcl7 中和抗体对类风湿关节炎骨破坏有明显的改善作用，为类风湿关节炎的治疗带来了新的希望。

研究结论与讨论

在这项研究中，研究人员发现 CXCL7 在类风湿关节炎患者的血浆中浓度升高，并且与疾病活动度和骨侵蚀密切相关。体外实验表明，CXCL7 能增强 RANKL 诱导的破骨细胞生成，促进骨吸收，其作用机制是通过激活 ERK/NFATc1 信号通路。在 CIA 小鼠模型中，Cxcl7 中和抗体能有效减轻关节炎症和骨破坏。这一系列研究结果表明，CXCL7 在类风湿关节炎的骨破坏过程中起到了重要作用，靶向 CXCL7 可能是治疗类风湿关节炎的一种新策略。

之前的研究也发现，CXCL7 在早期类风湿关节炎的滑膜中高表达，能帮助区分早期类风湿关节炎和缓解期关节炎，血小板来源的含有 CXCL7 的细胞外囊泡还能促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的侵袭和迁移。这些研究都和本次研究结果相互印证，进一步说明了 CXCL7 在类风湿关节炎发病机制中的重要性。同时，研究人员也指出，虽然靶向 CXCL7 展现出了治疗类风湿关节炎的潜力，但也存在一些问题需要进一步研究。比如，靶向 CXCL7 可能会影响炎症反应，进而影响巨噬细胞 / 单核细胞的数量，这可能会对破骨细胞的前体细胞产生影响；而且炎症的减轻也可能会减少各种炎症因子，这些炎症因子在破骨细胞生成过程中也起着重要作用。破骨细胞生成是一个非常复杂的过程，受到体内多种细胞因子网络的共同调节。此外，抗瓜氨酸化蛋白 / 肽自身抗体（ACPA）是否能调节 CXCL7 的表达，进而参与破骨细胞分化的调节，也需要在未来的研究中进一步明确。

总的来说，这项研究让我们对 CXCL7 在类风湿关节炎发病机制中的作用有了更深入的了解，为寻找类风湿关节炎的新型治疗靶点提供了坚实的实验依据。虽然目前还存在一些待解决的问题，但它为类风湿关节炎的治疗开辟了新的方向，相信在未来，随着研究的不断深入，针对 CXCL7 的治疗方法有望为广大类风湿关节炎患者带来更好的治疗效果，帮助他们减轻病痛，提高生活质量。