肺癌血浆循环微生物宏基因组独特特征及作为分子生物标志物的前沿探索

为解决肺癌早期诊断难题，北京首都医科大学附属北京朝阳医院（Beijing CapitalBio Medlab Co. Ltd）的研究人员开展肺癌血浆循环微生物宏基因组研究。结果发现其特征可区分患者与健康人，意义重大。强烈推荐科研读者一读！

　　

北京首都医科大学附属北京朝阳医院（Beijing CapitalBio Medlab Co. Ltd）的研究人员 Huijuan Chen 等人在《Journal of Translational Medicine》期刊上发表了题为 “Distinctive circulating microbial metagenomic signatures in the plasma of patients with lung cancer and their potential value as molecular biomarkers” 的论文。这篇论文在肺癌研究领域意义重大，为肺癌的早期诊断和治疗开辟了新的方向。

研究背景

肺癌（Lung Cancer，LC）一直是全球癌症死亡的主要原因，约占所有癌症相关死亡的 20% 。这主要是因为肺癌发病率高，而且很多患者确诊时已经处于晚期。目前，低剂量计算机断层扫描（Low-dose Computed Tomography，LDCT）是常用的肺癌筛查手段，多项随机对照试验表明，LDCT 筛查能降低肺癌相关死亡率，也被美国国家综合癌症网络指南推荐用于肺癌筛查 。然而，LDCT 存在一些局限性，比如筛查成本高、对个体有辐射剂量等问题。因此，寻找更有效的肺癌筛查方法至关重要，而分子生物标志物，尤其是血液中的分子生物标志物，有望在优化肺癌筛查标准和风险分层方面发挥重要作用。

近年来，随着高灵敏度技术如下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS）和组学技术的发展，癌症生物标志物的开发取得了很大进展。血浆中的多种分子，如循环肿瘤 DNA、循环肿瘤细胞和循环无细胞 RNA 等，都被认为是潜在的癌症早期检测生物标志物。无细胞核酸不仅携带人类遗传信息，还包含微生物组（包括癌症微生物组）的非人类遗传信息。已有研究发现，多种非传染性疾病患者的循环微生物谱存在差异，肿瘤组织中也发现了活细菌，且不同肿瘤类型的肿瘤内微生物组组成不同。另外，肿瘤患者和健康对照者（Healthy Controls，HCs）的循环微生物 DNA（Circulating Microbial DNA，cmDNA）也有显著差异。理论上，cmDNA 有潜力成为癌症液体活检的生物标志物。虽然在一些研究中发现了肺癌患者不同标本（如支气管肺泡灌洗液、痰液）中的菌群有明显变化，但关于血液中循环微生物宏基因组特征与肺癌相关性的研究较少。因此，研究肺癌患者循环微生物组特征及其潜在临床价值具有重要意义。

研究方法

1. 样本采集与研究设计：这是一项回顾性研究，研究人员收集了 2021 年 3 月至 2023 年 10 月在 Chosenmed Lab（北京）进行 NGS 检测的 76 例肺癌患者、9 例肝癌患者、11 例胰腺癌患者的外周血样本（约 10mL），以及 53 例健康志愿者的外周血样本作为对照。同时收集了 25 例新鲜肺癌肿瘤组织样本，用于探索肺癌肿瘤组织和血浆中宏基因组特征的相关性。样本采集前，对患者有严格的纳入和排除标准。采集的血液样本在 72 小时内制备血浆，且所有参与者都签署了符合赫尔辛基宣言的书面知情同意书，研究也获得了宣武医院伦理委员会的批准。样本被分为发现队列、验证队列和额外验证队列，用于后续不同阶段的分析。
2. 核酸提取、文库构建与测序：核酸提取、文库构建和测序在经美国病理学家学会认证的 NGS 实验室进行。血浆和组织中的总核酸分别使用 VAMNE 磁珠病原体 DNA/RNA 试剂盒和 TIANMicrobe 磁珠病原体 DNA/RNA 试剂盒提取。纯化后的核酸用 Qubit 4.0 荧光计定量，然后合成第一链 cDNA。血浆无细胞总核酸的测序文库用 Xgen cfDNA 和 FFPE DNA 文库制备试剂盒构建，组织核酸文库用全基因组测序文库制备试剂盒构建。最后，所有文库用 Qubit 4.0 荧光计定量，并在 MGISEQ - 2000 测序平台上进行 100bp 双端测序。为保证实验准确性，每批测序分析都设置了三种阴性对照。
3. 生物信息分析与数据净化：原始测序数据用 fastq 进行质量过滤、解复用和接头修剪。干净的读数用 Bowtie 2 比对到人类基因组 GRCh38/hg38，去除比对到 hg38、线粒体基因组或细菌质粒的读数。剩余读数用 Kraken 算法比对到微生物参考基因组数据库，该数据库包含 28,330 个微生物基因组。用 Bracken 方法估计每个样本在属和种水平的相对丰度，过滤掉相对丰度低于 0.01% 或读数计数低于 10 的分类单元。还用 decontam 软件的流行率（基于阴性对照）和频率（基于浓度）模式对 Kraken 计数的微生物数据进行净化。
4. 循环微生物标志物鉴定与分类器模型构建：使用 MaAslin 软件在发现队列中识别肺癌患者和健康对照者之间差异丰富的微生物物种（q 值 < 0.05），并调整年龄和性别等协变量。用随机森林分类器基于微生物谱预测肺癌，通过十折交叉验证（重复五次）训练分类器模型，选择预测肺癌的前五个微生物物种作为生物标志物集的最佳微生物物种。用 pROC 生成并计算受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线和曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）来评估模型性能。
5. 统计分析：用 R 包 amplicon 进行样本大小和微生物物种数量之间的稀疏分析。用 vegan 包计算 Simpson 指数或 Shannon 指数来确定微生物群落多样性，进行非度量多维缩放（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）和主坐标分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）。用 Wilcoxon 秩和检验进行微生物分类分析和两组间属和种水平的比较，并用 pheatmap 包可视化。用 t 检验、卡方检验或 Fisher 精确检验（使用 Prism 8 for Windows）比较肺癌患者和健康对照者样本的受试者差异和测序数据。

研究结果

1. 研究队列特征：研究共获得 159 份血浆样本和 25 份肺癌新鲜肿瘤组织样本。经过质量控制，最终对 149 份血浆样本（包括 76 例肺癌患者、53 例健康对照者、9 例肝癌患者和 11 例胰腺癌患者）和 24 份新鲜组织样本进行生物信息分析。患者被随机分为发现队列、验证队列和额外验证队列。肺癌患者和健康对照者在性别和年龄上没有显著差异，发现队列中大多数肺癌患者处于 II 期和 III 期，验证队列中大多数处于 I - II 期。
2. 肺癌患者和健康对照者循环微生物宏基因组谱的多样性：测序数据质量控制和过滤后，肺癌血浆样本和健康对照者血浆样本的总清洁读数和微生物读数（包括细菌、真菌和病毒）没有显著差异。稀疏分析表明，肺癌组和健康对照组的物种丰富度都接近饱和。经过一系列净化过滤后，在肺癌患者和健康对照者的血浆样本中共鉴定出 563 个物种，其中 123 个物种是两组共有的。肺癌组观察到的物种数量显著高于健康对照组，Simpson 多样性指数也更高，但 Shannon 多样性指数没有差异。NMDS 和 PCoA 分析显示，肺癌组和健康对照组的循环微生物宏基因组谱存在差异。
3. 肺癌患者和健康对照者循环微生物宏基因组谱的差异：肺癌患者有独特的循环微生物谱，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）、痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是肺癌样本中相对丰度最高的五个物种。在属水平上，肺癌样本中克雷伯菌属、沙门氏菌属、丙酸杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和马拉色菌属的丰度显著高于健康对照者，而假单胞菌属、奈瑟菌属、拉尔氏菌属和巴斯德菌属的丰度较低。在种水平上，肺炎克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、无枝菌酸棒杆菌（Corynebacterium amycolatum）和产色短杆菌（Brevibacterium pigmentatum）在肺癌样本中的丰度显著高于健康对照者，而淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）的丰度较低。
4. 循环微生物宏基因组面板作为肺癌患者潜在的新型诊断生物标志物：在发现队列中，MaAslin 软件分析发现 20 种微生物在肺癌患者中显著富集，5 种微生物在健康对照者中显著富集。随机森林分类器模型从肺癌患者和健康对照者样本中筛选出 5 种微生物（Microvirgula aerodenitrificans、Komagataella phaffii、Alternaria incomplexa、Ogataea philodendri 和金黄色葡萄球菌）作为肺癌的最佳微生物标志物。在发现队列、验证队列和额外验证队列中，基于这 5 种微生物构建的分类器模型的 AUC 值分别为 0.9592、0.9131 和 0.8077，表明该模型能有效区分肺癌患者和健康对照者以及其他癌症患者，说明血液中的循环微生物有潜力成为肺癌的非侵入性诊断生物标志物。
5. 肺癌肿瘤组织和血浆中微生物宏基因组谱的比较：对 25 对肺癌组织和血液样本进行 WGS 分析，其中 24 对样本用于下游分析。肿瘤组织和血浆样本的总测序读数没有差异，但肿瘤组织中的非人类读数、微生物读数和微生物计数（包括细菌、真菌和病毒）显著高于血浆。在 24 对样本中鉴定出 514 个物种，其中 66 个物种是血浆和组织共有的。血浆中的微生物多样性显著高于组织，NMDS 分析显示血浆和组织的微生物组成有重叠。在属和种水平上，肿瘤组织和配对血浆样本中一些微生物的相对丰度存在差异。定义核心微生物物种后，发现 26 个核心微生物物种，其中 13 个是血浆和组织共有的，10 个和 3 个分别是血浆和组织特有的。在 13 个共有的核心微生物物种中，10 个在组织和配对血浆样本中没有差异。

研究结论与讨论

研究人员通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）的宏基因组分析，全面描绘了肺癌患者血浆中的循环微生物谱。肺癌患者和健康对照者的微生物谱在组成和丰度上有显著差异，基于随机森林算法筛选出的 5 种微生物物种作为肺癌预测生物标志物面板，在区分肺癌患者和健康对照者方面表现良好，这表明循环微生物核酸有潜力成为肺癌液体活检的生物标志物。

同时，研究还比较了肺癌肿瘤组织和配对血浆样本的微生物谱。虽然肿瘤组织中的微生物物种数量和多样性低于血浆，但 13 个共有的核心微生物物种中有 10 个在两者之间没有差异，这表明肿瘤内微生物组可能是循环微生物核酸的来源之一，但这一结论还需要进一步研究来证实。

不过，该研究也存在一些局限性。首先，这是一项回顾性分析，样本量有限，需要更大样本量的前瞻性研究来验证研究结果。其次，研究没有根据肺癌的组织学亚型和疾病阶段来确定血浆微生物特征，也没有考虑吸烟史和日常饮食等因素，而这些因素可能会影响肺癌微生物组。最后，虽然发现了循环微生物核酸作为肺癌诊断生物标志物的潜力，但它们在肺癌发展中的机制作用以及来源仍不清楚，作为预后生物标志物的潜力也未知。

总体而言，这项研究为肺癌的诊断和循环微生物核酸来源的探索提供了重要线索，尽管还有很多未知需要进一步研究，但它为肺癌研究领域打开了新的大门，有望推动肺癌早期诊断和治疗技术的发展。