肺炎克雷伯菌携带 blaOXA - 232 质粒群体异质性研究：解锁碳青霉烯耐药、毒力与适应性新机制

为解决肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药及群体异质性相关问题，韩国成均馆大学医学院的研究人员开展了携带质粒肺炎克雷伯菌的研究。结果揭示了耐药、毒力和适应性变化机制。推荐阅读，助您洞察该领域前沿进展！

　　

韩国成均馆大学医学院微生物学系（Department of Microbiology, Sungkyunkwan University School of Medicine）的 Yun Young Cho、Sun Ju Kim 以及 Kwan Soo Ko 等研究人员在《Journal of Biomedical Science》期刊上发表了题为 “Emergence of population heterogeneity in Klebsiella pneumoniae with a -harboring plasmid: carbapenem resistance, virulence, and fitness” 的论文。这篇论文在医学健康领域，尤其是针对细菌耐药性和异质性研究方面具有重要意义，它深入剖析了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）携带特定质粒后在碳青霉烯耐药性、毒力和适应性等方面的变化，为临床治疗和防控耐药菌感染提供了关键依据 。

研究背景

在医学领域，抗生素耐药菌株的出现和传播严重限制了治疗手段。碳青霉烯类抗生素作为治疗严重细菌感染的重要药物，细菌对其耐药性的不断增强引发了极大担忧，这与更高的发病率和死亡率密切相关。肺炎克雷伯菌作为引发碳青霉烯耐药的主要病原体之一，它能通过多种机制产生耐药性，比如上调外排泵（efflux pumps，一种能将抗生素排出细菌细胞的蛋白结构 ）、降低细胞膜通透性、产生碳青霉烯酶（carbapenemases，可分解碳青霉烯类抗生素的酶 ）等。

除了这些传统的耐药机制，细菌群体异质性（population heterogeneity，指在同基因群体中存在具有不同特征的个体，如对抗生素敏感性不同 ）也给治疗带来了极大挑战。群体异质性不仅源于表型可塑性，还与基因变异有关，被认为是细菌在波动环境（如抗生素暴露 ）下增强生存能力的 “套期保值” 策略。细菌群体中的异质性使得标准的抗菌药敏试验难以检测到少数亚群，因为这些试验通常是针对均质样本设计的。

其中，抗生素异质性耐药（antibiotic heteroresistance，指在主要为敏感的群体中存在抗生素耐药亚群 ）是细菌中常见的群体异质性现象。耐药亚群通常以低频率（ 至 ）存在，常规诊断方法很难检测到。但一旦接触抗生素，耐药细胞会迅速增殖，极有可能导致治疗失败。不过，“异质性耐药” 这一术语并不能完全体现主要群体中存在不同抗生素耐药水平亚群的情况。

目前，关于细菌群体异质性的形成、维持以及它如何促使抗生素耐药性增加的过程，人们了解得还很有限。在这样的背景下，该研究聚焦于碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌获得携带碳青霉烯酶基因的质粒后，群体异质性的出现，以及其如何发展为稳定的碳青霉烯耐药表型，并探究了相关的遗传因素。

研究方法

1. 细菌和质粒：研究使用的携带碳青霉烯酶基因 的质粒来自肺炎克雷伯菌临床分离株 M5（属于 ST11 型 ）。该 ColE 型质粒 pOXA232 长度为 6141bp，包含复制酶基因、 、一个假定基因、一个移动基因盒（MOB 模块 ）、与红霉素耐药相关的非编码部分 EreA 基因和部分 vbhA 基因。研究人员将提取的质粒通过电穿孔法导入从患者血液中获取的两种碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌 ST11 菌株 KCS20 和 KCS22 中。
2. 抗生素敏感性测试：采用肉汤微量稀释法，按照临床和实验室标准协会（CLSI ）指南，测定野生型肺炎克雷伯菌分离株（KCS20 和 KCS22 ）及其 pOXA - 232 转化子和后续获得菌株对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、四环素、阿米卡星、粘菌素、叠氮胸苷和氯霉素的最低抑菌浓度（MIC ）。
3. 时间杀菌试验：依据 CLSI 指南进行。将过夜培养的细菌以 1:100 的比例稀释到含有 8mg/L 亚胺培南的 10mL Mueller - Hinton（MH ）II 肉汤中，在 37°C、220rpm 振荡条件下培养 24h。在 0、3、6、9 和 24h 使用斑点试验法测定活菌数，结果以 CFU/mL 表示，实验重复三次。
4. 平板点种：在含有 pOXA - 232 的转化子（KCS20T 和 KCS22T ）中，通过平板点种法识别和分离高碳青霉烯耐药（HCR ）和低碳青霉烯耐药（LCR ）群体。将混合转化子在 37°C、220rpm 振荡培养过夜后，涂布在非选择性血琼脂平板上。从每个平板随机选取 25 个菌落，点种到含有高（32mg/L ）、低（1mg/L ）浓度美罗培南的新琼脂平板上。过夜培养后，在高、低浓度美罗培南平板上都能生长的菌株被归类为 HCR 表型，仅在低浓度平板上生长的为 LCR 表型。
5. 群体分析谱（PAP ）：对菌株进行 PAP 分析以鉴定碳青霉烯异质性耐药。将过夜培养物在磷酸盐缓冲盐水（PBS ）中稀释 10 倍，然后涂布在含有美罗培南浓度呈 2 倍梯度的 MH II 琼脂平板上（野生型菌株浓度为 0.015 - 8mg/L，KCS20T/H - Hr 和 KCS22T/H - Hr 菌株为 2 - 64mg/L ）。37°C 孵育 24h 后计算 CFU。异质性耐药定义为存在 MIC 在 至 频率范围内的耐药亚群。
6. 细菌生长曲线：测量野生型菌株及其转化子的生长情况。将过夜的 LB 培养物调整至麦氏标准 0.5，以 1:100 的比例稀释到新鲜 LB 肉汤中，在 37°C、220rpm 振荡条件下每 2h 测量一次 600nm 处的光密度（OD600 ）。使用 Student's t 检验分析生长曲线，实验独立进行三次。
7. 竞争试验：对同基因转化子 KCS20T/H 与 KCS20T/L、KCS22T/H 与 KCS22T/L 进行体外竞争试验。将菌液调整至麦氏标准 0.5，以 1:1 的比例混合在 10mL LB 肉汤中，37°C、220rpm 振荡培养 24h。通过连续 10 倍稀释和在含有 32mg/L 和 2mg/L 美罗培南的 LB 琼脂平板上进行斑点试验评估存活率，计算竞争指数（CI ）。
8. 表型稳定性试验：将转化子在 37°C、220rpm 振荡的非选择性液体培养基中传代培养 20 天，评估碳青霉烯耐药表型的稳定性。每天将液体培养物在 PBS 中连续稀释，在含有高（32mg/L ）、低（1mg/L ）浓度美罗培南的 Luria - Bertani（LB ）琼脂平板上进行斑点试验。过夜培养后计数 CFU，计算每种表型的存活率。通过 PCR 和抗菌药敏试验确认 pOXA - 232 的存在和碳青霉烯耐药性的变化。
9. 血清杀菌试验：对野生型菌株及其转化子 KCS20T/H、KCS20T/L、KCS22T/H 和 KCS22T/L 进行人血清抗性试验。将对数中期培养物用正常人血清（NHS ）或热灭活的人血清（HIS ）处理，37°C、220rpm 振荡孵育 3h 后，用 PBS 洗涤，连续稀释，在 LB 琼脂平板上进行斑点试验。通过 NHS 处理后的 CFU 除以 HIS 处理后的 CFU 计算存活率，所有菌株的试验均重复三次。
10. 蜡螟幼虫感染试验：通过蜡螟幼虫体内注射实验比较同基因转化子的毒力。KCS20T/H 和 KCS20T/L 以 CFU/mL 的浓度注射，KCS22T/H 和 KCS22T/L 以 CFU/mL 的浓度注射，连续四天记录死亡数量。
11. 碳青霉烯酶、ompK36、ompK35 和毒力基因表达分析：使用定量实时 PCR（qRT - PCR ）比较 KCS20 和 KCS22 转化子中 、毒力基因（clbA、clbB、ybtS、fyuA、entB、irp2、fimH、traT ）、应激反应转录因子（ramA、soxS、marA、rpoS、clpB ）和孔蛋白（ompK35 和 ompK36 ）的 mRNA 表达水平。
12. 全基因组测序：对每对 HCR 和 LCR 菌株以及 KCS20T/H - Hr 和 KCS22T/H - Hr 进行全基因组测序。提取基因组 DNA 并进行文库制备，分别使用 MinION 测序仪和 Illumina NovaSeq 6000 系统进行长读长和短读长测序。
13. 统计分析：使用 Prism 8.3.0 软件中的 Student's t 检验进行统计分析，设定显著性水平为 span data-custom-copy-text="\(p0.05\)"（" ）、span data-custom-copy-text="\(p0.01\)"（* ）或 span data-custom-copy-text="\(p0.001\)"（* ）。

研究结果

1. 两个亚群的鉴定和分离：将携带 的质粒导入 41 株非碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌分离株后，发现 KCS20T 和 KCS22T 转化子的时间杀菌分析结果在 3h 后出现较大偏差。通过平板点种，在转化子中鉴定出具有两种显著不同碳青霉烯耐药谱的亚群，MLST 证实两个亚群均属于 ST11 型，PCR 和 Sanger 测序确认两个亚群都含有 pOXA - 232。PAP 分析显示野生型菌株对美罗培南无异质性耐药表型。进一步的时间杀菌试验表明，HCR 亚群（KCS20T/H 和 KCS22T/H ）从培养开始存活率就较高，而 LCR 群体（KCS20T/L 和 KCS22T/L ）存活率下降且速度比敏感野生型慢。
2. 转化子亚群间碳青霉烯耐药性的差异及 的表达：两个转化子亚群的碳青霉烯 MIC 差异超过 16 倍，HCR 亚群 MIC 高于 64mg/L，LCR 亚群为 4mg/L。转化子对其他抗生素的 MIC 没有增加，除碳青霉烯类外，两个亚群的药敏谱无差异。各对转化子亚群间 的表达水平与参考菌株 E. coli MG1655 转导 pOXA - 232 相比均显著增加，但亚群间无显著差异。
3. 生长、适应性和表型稳定性：生长曲线分析表明，LCR 亚群与野生型生长速率相似，HCR 亚群（KCS20T/H 和 KCS22T/H ）生长速率显著低于野生型和 LCR 亚群。但从无抗生素培养基中具有抗性的异质性菌株获得的 HCR 亚群（KCS20T/H - Hr/H 和 KCS22T/H - Hr/H ）恢复了野生型的生长速率。体外竞争试验显示，无美罗培南时，LCR 亚群在两对菌株中均优于 HCR 亚群；低浓度美罗培南（0.5mg/L ）时，HCR 亚群显著优于 LCR 亚群。表型稳定性分析发现 HCR 不稳定，在无抗生素培养基中传代培养 20 天，KCS20T/H 和 KCS22T/H 的存活率下降，且出现 LCR 表型。从 HCR 亚群传代培养 20 天后分离出的异质性菌株 KCS20T/H - Hr 和 KCS22T/H - Hr 经 PAP 分析显示为异质性，其中 HCR 亚群比例约为 。通过平板点种分离出的 HCR 亚群（KCS20T/H - Hr/H 和 KCS22T/H - Hr/H ）生长速率无下降且抗性表型稳定。
4. 转化子亚群间毒力的差异：在体外人血清试验中，HCR 亚群在两对转化子中的存活率均高于 LCR 亚群，且显著高于相应的野生型。在体内蜡螟幼虫感染试验中，HCR 和 LCR 亚群的毒力均高于相应野生型，但两对亚群间无统计学差异。qRT - PCR 检测发现，HCR 群体中 fimH、traT 和 soxS 的表达显著高于 LCR 亚群。
5. 基因组比较：全基因组测序鉴定出多个单核苷酸多态性（SNPs ），其中仅 ompK36 出现一处破坏。KCS20T/H 的 ompK36 存在 259bp 缺失，导致产生功能失调的 OmpK36；KCS22T/H 的 ompK36 发生氨基酸替换，引起移码突变和提前终止。LCR 亚群的 ompK36 无突变。mRNA 表达分析进一步证实，KCS20T/H 和 KCS22T/H 细胞中 ompK36 不表达或表达水平极低。此外，ompK35 和 ompK36 的功能相互影响，ompK36 表达低或无表达的菌株中 ompK35 表达较高。
6. 异质性菌株的基因改变：除 ompK36 外，KCS20T/H - Hr 和 KCS22T/H - Hr 还存在其他基因改变，均有大约 9000bp 的缺失，包含多个基因。KCS20T/H - Hr 在缺失区域有 702bp 的序列插入。这些缺失和插入在后续分离的稳定 HCR 亚群 KCS20T/H - Hr/H 和 KCS22T/H - Hr/H 中依然存在。

研究结论与讨论

碳青霉烯耐药性在肺炎克雷伯菌中是一个严峻问题，群体异质性加速了耐药性的进化。该研究通过将携带 的质粒导入碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌，鉴定出 HCR 和 LCR 两个转化子亚群。研究发现，HCR 亚群在无碳青霉烯环境中竞争力较弱且表型不稳定，但在碳青霉烯存在时具有优势。

qRT - PCR 分析表明，碳青霉烯 MIC 的差异并非由 表达差异引起，而是与 ompK36 功能失调有关。ompK36 是碳青霉烯进入细胞的主要孔蛋白，其功能缺失或低表达会导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯耐药。HCR 亚群毒力基因表达更高，可能与 ompK36 功能缺失影响其他基因有关。

此外，HCR 亚群传代培养得到的 LCR 菌株具有异质性表型，与经典异质性耐药不同，其主要群体为 LCR 且包含 HCR 亚群。在异质性菌株中诱导出的稳定 HCR 表型，具有更高的生长速率，除了 ompK36 缺陷外还存在额外的补偿性突变，这些突变可能通过影响 DNA 甲基化、错配修复等过程，促使稳定 HCR 亚群的出现，体现了细菌的 “套期保值” 策略。

该研究强调了认识临床致病群体中隐藏异质性的重要性。尽管研究对象仅为两株肺炎克雷伯菌分离株，但未检测到的异质性可能导致稳定的高抗生素耐药性，进而造成治疗失败。理解这些机制对于解决碳青霉烯单药治疗失败、感染复发问题，以及制定减轻临床环境中抗生素耐药异质性影响的策略至关重要，为后续临床治疗和防控耐药菌感染提供了重要的理论基础和研究方向。