新型 5’tRNA 衍生片段 tRF-Tyr 靶向 hnRNPD 抑制胃癌进展的前沿研究

为探究 tsRNAs 在胃癌中的作用机制，山东第一医科大学附属山东省立医院等单位的研究人员开展 tRF-Tyr 相关研究。结果发现 tRF-Tyr 可抑制胃癌进展。这为胃癌治疗提供新靶点，极具科研价值，推荐阅读。

　　

山东第一医科大学附属山东省立医院胃肠外科等多个单位的研究人员，在《Cell Communication and Signaling》期刊上发表了名为 “A novel 5’tRNA-derived fragment tRF-Tyr inhibits tumor progression by targeting hnRNPD in gastric cancer” 的论文。这篇论文在胃癌研究领域意义重大，为深入理解胃癌的发病机制以及开发新的治疗靶点提供了关键线索。

研究背景

胃癌（Gastric cancer，GC）严重威胁人类健康，每年全球新增病例超 100 万，是第五大常见恶性肿瘤，在世界多数地区病死率高达 75% ，给全球尤其是东亚国家的人们带来了沉重负担。因此，探索胃癌发生发展的机制，寻找新的治疗方法成为该领域研究的重点。

非编码 RNA（ncRNA）在肿瘤研究中备受关注，其中 tRNA 衍生的小 RNA（tsRNAs）作为一类新型非编码 RNA，成为肿瘤研究的新焦点。tsRNAs 分为 tRNA 半分子（tiRNAs）和 tRNA 衍生片段（tRFs），已有研究表明 tsRNAs 在多种肿瘤中具有致癌或抑癌作用，但 tRFs 在胃癌中的具体分子机制仍不明确。研究人员通过高通量测序发现一种名为 tRF-Tyr（ID：tRF-16-ROD8N0E）的 5a 型 tRF 在胃癌组织中显著下调，其由 16 个核苷酸组成，位于线粒体基因组特定位置。他们推测 tRF-Tyr 可能通过竞争抑制异质核核糖核蛋白 D（hnRNPD）/ 富含 AU 元件 RNA 结合蛋白 1（AUF1）与 c-Myc 的 3′非翻译区（3′UTR）结合，从而影响胃癌的发展，因此开展了此项研究。

研究方法

1. 组织标本和细胞系：研究使用了山东省立医院 2013 - 2023 年胃癌患者手术切除的癌组织及配对正常组织，所有患者术前未接受新辅助治疗，组织均经病理诊断。同时使用了多种胃癌细胞系（AGS、MKN-28、HGC-27、MKN-45）、永生化人胃上皮细胞系 GES-1 和人胚肾细胞系 HEK-293T，所有细胞系均经过验证且无支原体污染。

2. tsRNA 测序和数据分析：采用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，Agilent Bioanalyzer 2100 进行序列库质量控制，按照既定方案进行 tsRNA 测序和数据分析。

3. RNA 提取和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）：使用 TRIzol 从组织和细胞系中提取 RNA，经预处理去除 RNA 修饰并连接接头，通过反转录合成 cDNA，再用 qRT-PCR 进行扩增，以 β-actin 为 mRNA 内参，U6 为 tRF-Tyr 内参，采用法计算 RNA 表达水平。

4. 荧光原位杂交（FISH）：合成 Cy3 标记的 tRF-Tyr 探针，利用 RNA FISH 试剂盒进行实验，以 U6 和 18S 分别作为细胞核和细胞质的对照，通过荧光显微镜观察荧光信号。

5. 细胞转染：构建 tRF-Tyr 过表达模型（oe-Tyr）、抑制模型（ih-Tyr），以及 hnRNPD 过表达模型（oe-hnRNPD）、干扰模型（si-hnRNPD），并设置相应阴性对照，通过 qRT-PCR 和蛋白质免疫印迹（WB）验证转染效率。

6. 细胞功能实验：运用 CCK-8 法检测细胞增殖能力；进行集落形成实验评估细胞克隆形成能力；采用流式细胞术检测细胞凋亡；利用 Transwell 侵袭实验和划痕愈合实验分别测定细胞侵袭和迁移能力。

7. 机制研究实验：RNA pull-down 实验结合质谱分析筛选 tRF-Tyr 结合蛋白；进行 RNA 免疫沉淀（RIP）实验验证 tRF-Tyr 与 hnRNPD 的结合；构建双荧光素酶报告基因载体，检测 tRF-Tyr 与 c-Myc 3′UTR 的相互作用；通过 WB 实验检测相关蛋白表达水平。

8. 体内成瘤实验：选取 4 周龄 BALB/c 裸鼠，将稳定表达 oe-NC 或 oe-Tyr 的 MKN-45 细胞注射到裸鼠左腋皮下，每周测量肿瘤体积，4 周后解剖肿瘤进行 WB 和免疫组织化学（IHC）检测。

9. 统计分析：运用 SPSS 27.0 软件进行统计分析，根据不同数据类型选择合适的统计检验方法，以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。

研究结果

1. tRF-Tyr 在胃癌中表达下调：对 4 对肿瘤和正常组织进行高通量测序，发现 tRFs 在胃癌组织和配对正常组织中的亚型分布和长度存在差异，tRF-Tyr 在胃癌组织中显著下调。通过 qRT-PCR 检测 70 例胃癌及配对正常组织，进一步验证了这一结果，且其表达与肿瘤侵袭性、淋巴结转移、TNM 分期和肿瘤大小呈负相关，与患者总生存期（OS）呈正相关。同时，胃癌细胞系中 tRF-Tyr 表达低于 GES-1 细胞系，HGC-27 和 MKN-45 细胞中表达最低。

2. tRF-Tyr 的亚细胞定位：FISH 实验显示，胃癌组织和细胞系中 tRF-Tyr 的荧光强度低于正常组织和 GES-1 细胞，且在肿瘤细胞的细胞核中荧光强度减弱，提示 tRF-Tyr 可能在细胞核中发挥重要分子功能，其核内表达减少可能促进胃癌的恶性发展。

3. tRF-Tyr 抑制胃癌细胞体外增殖、侵袭和迁移并促进凋亡：在 HGC-27 和 MKN-45 细胞中构建 tRF-Tyr 过表达和抑制模型，实验结果表明，过表达 tRF-Tyr 显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡；抑制 tRF-Tyr 则产生相反效果，说明 tRF-Tyr 在体外可作为抑癌基因抑制胃癌细胞的恶性发展。

4. tRF-Tyr 直接结合 hnRNPD 蛋白：以 MKN-45 细胞为研究对象进行 RNA pull-down 实验，结合质谱分析发现 hnRNPD 是 tRF-Tyr 的结合蛋白。通过独立的 RNA pull-down 和 WB 实验，以及 RIP 实验进一步验证了二者的直接结合。同时发现，hnRNPD 在胃癌组织中高表达，促进胃癌细胞增殖并抑制凋亡，但 tRF-Tyr 与 hnRNPD 的结合不影响彼此的表达水平，提示 tRF-Tyr 可能通过其他机制发挥抑癌作用。

5. tRF-Tyr 靶向 hnRNPD 竞争性结合 c-Myc：通过救援实验发现，hnRNPD 过表达可逆转 tRF-Tyr 过表达对胃癌细胞增殖、凋亡的抑制作用；hnRNPD 敲低则使 tRF-Tyr 抑制对细胞增殖、凋亡的促进作用消失。研究人员发现 tRF-Tyr 与 c-Myc 3′UTR 存在 9 个相同核苷酸序列，通过 RNA pull-down 和双荧光素酶报告基因实验证实，tRF-Tyr 可通过该序列占据 hnRNPD 与 c-Myc 3′UTR 的结合位点，抑制 c-Myc 翻译，从而发挥抗癌作用。

6. tRF-Tyr 调节 c-Myc/Bcl2/Bax 通路：WB 救援实验表明，tRF-Tyr 通过竞争结合 hnRNPD 与 c-Myc 3′UTR，调节 c-Myc 蛋白表达，进而影响 Bcl-2 和 Bax 蛋白水平。过表达 tRF-Tyr 降低 c-Myc 和 Bcl-2 表达，增加 Bax 表达；抑制 tRF-Tyr 则相反，且这些作用可被 hnRNPD 的过表达或敲低所逆转。

7. 过表达 tRF-Tyr 抑制胃癌体内生长：建立裸鼠皮下成瘤模型，将稳定过表达 tRF-Tyr 的 MKN-45 细胞注射到裸鼠体内，4 周后发现，与对照组相比，过表达 tRF-Tyr 组的肿瘤更小、更轻，且肿瘤组织中 c-Myc 和 Bcl-2 表达下调，Bax 表达上调，表明 tRF-Tyr 在体内也能抑制胃癌生长。

研究结论与讨论

研究表明，tRF-Tyr 是一种新发现的胃癌抑癌 tRF。它在体外能抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡；在体内可抑制肿瘤生长。其作用机制是 tRF-Tyr 直接结合 hnRNPD，竞争性抑制 hnRNPD 与 c-Myc 3′UTR 的结合，从而抑制 hnRNPD 对 c-Myc mRNA 的翻译促进作用，调节 c-Myc/Bcl2/Bax 通路，最终抑制胃癌的恶性程度。

尽管该研究取得了重要成果，但仍存在一些局限性。例如，导致细胞产生较少 tRF-Tyr 的具体应激条件尚未明确，调节 tRF-Tyr 亚细胞定位的因素也未确定。在实验技术方面，FISH 检测可能存在部分不稳定 tRNA-Tyr 降解为单链 RNA 而被误检测的情况。此外，研究仅建立了皮下肿瘤模型，缺乏 tRF-Tyr 对肿瘤转移影响的体内实验证据，且 tRF-Tyr 与 hnRNPD 结合的具体位点、条件以及是否有其他分子参与等问题也有待进一步研究。

不过，这项研究为胃癌的研究开辟了新的方向。tRF-Tyr 作为潜在的治疗靶点，为未来开发针对胃癌的靶向治疗策略提供了理论依据。后续研究可针对上述局限性展开，深入探索 tRF-Tyr 的作用机制，有望为胃癌的治疗带来新的突破，为广大胃癌患者带来新的希望。