新型环保纳米胶体提升黑豆种子活力的前沿实验与计算分析

为解决黑豆种子储存期易变质问题，印度泰米尔纳德农业大学的研究人员开展 PZCA-NCs 提升黑豆种子活力的研究。结果显示该纳米胶体效果显著。此研究为农业种子储存提供新方案，极具科研价值，推荐大家阅读。

　　

印度泰米尔纳德农业大学（Tamil Nadu Agricultural University）农业纳米技术中心的 K. Madhan 等研究人员在《BMC Plant Biology》期刊上发表了题为 “Eco-friendly nano colloids for enhanced black gram (Vigna mungo) seed viability: experimental and computational analysis” 的论文。这篇论文在农业种子科学领域意义重大，为提高黑豆（Vigna mungo）种子活力、延长种子储存期提供了新的思路和方法，有助于推动绿色农业的发展，减少化学农药和保鲜剂的使用，保障生态环境安全。

研究背景

在农业领域，种子质量对于作物产量和质量至关重要。然而，种子在储存过程中，常因生物和非生物因素的影响而发生变质，其中脂质氧化会破坏细胞膜，导致种子活力下降。传统的种子处理方法存在诸多弊端，如化学农药会造成环境污染和生物积累。因此，开发环保、高效的种子处理技术迫在眉睫。纳米技术在农业中的应用为解决这一问题带来了新的契机，纳米胶体种子处理技术可有效提高种子质量，增强种子活力。

本研究聚焦于开发一种基于玉米醇溶蛋白（Zein）、姜黄素（Curcumin）和印楝素（Azadirachtin）的纳米胶体系统，用于延长黑豆种子的储存期，并探究该胶体系统的电子结构、几何形状和化学反应性。Zein 作为种子包衣剂，能延缓种子对水分的吸收和萌发；姜黄素具有抗氧化特性，可减少脂质氧化，保护细胞膜；印楝素则是一种生物农药，能有效防治害虫，保护种子。将这些成分结合，有望开发出一种高效、环保的种子处理剂。

研究方法

1. 合成 PZCA-NCs：研究人员从 Sigma Aldrich 公司购买分析级的姜黄素、印楝素和玉米醇溶蛋白，从 Merck 公司购买稳定剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。将优化浓度的姜黄素（80mg）和印楝素（10mg）在乙醇中混合，再与 2% 的玉米醇溶蛋白溶液在 pH5 - 5.2、40°C 条件下搅拌反应，使生物活性物质与玉米醇溶蛋白结合。随后，通过离心、静置和过滤等步骤，得到玉米醇溶蛋白包裹姜黄素和印楝素的纳米胶体溶液，再加入 0.5% 的 PVP 进行稳定化处理，最终获得 PZCA-NCs（Polyvinylpyrrolidone-coated zein-zipped herbal molecules infused nano colloids）。
2. 表征研究：运用多种技术对 PZCA-NCs 进行全面表征。利用 UV-visible 光谱仪在 200 - 1100nm 范围内测定其吸光度，以此计算姜黄素和印楝素的包封率；采用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）在 400 - 区间检测，确定生物分子的存在和功能基团；通过热重分析仪（TG/DTA-EXSTAR/6300）分析 PZCA-NCs 的热稳定性；使用纳米颗粒分析仪（Nanopartica SZ-100）和 zeta 电位分析仪测定其粒径、分布和表面电荷；借助 X 射线衍射仪（XRD）分析结构；运用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察表面和内部形态；利用核磁共振波谱仪（NMR）获取结构和动力学信息。
3. 计算研究：运用密度泛函理论（DFT），在 Gaussian 09 软件的 B3LYP/6 - 31G (d, p) 水平下进行气相计算。对分子进行优化和频率计算，确保其处于基态稳定状态。通过前沿分子轨道（FMO）和静电势（ESP）分析，深入了解分子的化学反应性和稳定性。同时，使用 AlphaFold 和 Maestro 软件对玉米醇溶蛋白进行建模和分子对接研究，预测分子与蛋白的结合模式。
4. 体外控制释放研究：采用透析扩散技术，将 15mL 的 PZCA-NCs 装入透析袋，放入 50mL 磷酸盐缓冲液中，在室温下以 100 - 的速度振荡。定期取出 3mL 溶液进行检测，并用 3mL 磷酸盐缓冲液补充，以维持恒定体积。利用 UV-Vis 扫描仪分析生物分子的释放模式，并通过不同动力学模型（如 Korsmeyer-Peppas 模型、一级模型、零级模型、Higuchi 模型）计算回归系数（），评估释放规律。
5. 生物功效测试：选取 100g 遗传纯度高的黑豆种子，分别用不同剂量（5 - 40mL/kg）的 PZCA-NCs 进行包衣处理，并设置未处理的种子作为对照。将处理后的种子进行加速老化处理 10 天，之后测试种子的发芽率、根长、苗长、干物质产量、活力指数等生理指标；测定种子的电导率、α - 淀粉酶、脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和脂质过氧化物等生化指标；通过将种子放置在含有 0.2% 2,4 - 二氯苯氧乙酸溶液的无菌滤纸上，在特定光照条件下培养，检测种子的储存病原体感染情况。
6. 生物测定测试：以不同剂量的 PZCA-NCs 处理黑豆种子，放入含有 15 对成年绿豆象（Callosobruchus maculatus）的塑料容器中，在 27 ± 3°C 和 70% 相对湿度条件下，记录 7 天内昆虫的死亡率，以此评估 PZCA-NCs 对绿豆象的毒性；将不同浓度的 PZCA-NCs 与马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基混合，接种菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）真菌圆盘，测量真菌菌丝生长抑制区，评估 PZCA-NCs 对该真菌的抑制效果。
7. 生物安全性测试：将不同浓度的 PZCA-NCs 与营养琼脂培养基混合，接种巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），在 37 ± 10°C 条件下培养 3 天，计数细菌菌落，评估 PZCA-NCs 对有益微生物的安全性。所有实验均采用析因完全随机区组设计（FCRD），进行四次重复，并进行统计分析。

研究结果

1. PZCA-NCs 的吸光度和稳定性：UV-Vis 光谱显示，PZCA-NCs 在 298、404 和 430nm 处有明显吸收峰，证实了姜黄素和印楝素的存在，其包封率分别为 73.44% 和 69%。PZCA-NCs 的粒径为 151nm，zeta 电位为 44.5mV，一个月后为 43.8mV，两个月后为 38.4mV，表明其具有良好的稳定性。这得益于 PVP 浓度的增加以及低浓度姜黄素和印楝素的添加，避免了颗粒的聚集。
2. PZCA-NCs 的功能和衍射模式：FT-IR 光谱表明，PZCA-NCs 具有与纯玉米醇溶蛋白、姜黄素和印楝素相似的功能基团。XRD 分析显示，姜黄素具有明显的衍射峰，而印楝素为无定形，PZCA-NCs 呈波浪状无定形，有一个小峰位于 19.76°，表明姜黄素在玉米醇溶蛋白溶液中发生了变化，以无定形状态存在。
3. PZCA-NCs 的差热变化：热重分析（TG）结果显示，PZCA-NCs 在 300°C 以下较为稳定，300 - 380°C 之间重量快速下降，损失率达 24.2%。差热分析（DTA）表明 PZCA-NCs 发生了放热反应，初始重量损失是由于残留乙醇和水的蒸发。
4. PZCA-NCs 的表面形态和尺寸：SEM 图像显示，PZCA-NCs 由球形胶体颗粒组成，粒径范围为 233.1 - 349.7nm；TEM 图像进一步证实了其核壳结构，粒径在 69 - 281nm 之间。EDAX 分析表明，PZCA-NCs 中含有大量的碳和氧，以及一定量的氮，证明了草药化合物和蛋白质的存在。
5. PZCA-NCs 的 NMR 光谱： NMR 光谱显示，姜黄素和印楝素的生物分子存在明显的峰，但与 PZCA-NCs 中的峰并不完全匹配。这是由于两种分子在与玉米醇溶蛋白结合时发生了去质子化，并形成了氢键、范德华力或 π - π 相互作用。
6. PZCA-NCs 的分子对接：分子对接研究表明，姜黄素与玉米醇溶蛋白的结合能力强于印楝素。姜黄素通过 OH 基团与蛋白质的 SER160 氨基酸形成氢键，以及苯环与 Phe203 氨基酸形成 π - π 堆积相互作用；印楝素则通过与 Asp207 和 Ser162 氨基酸形成氢键与蛋白质结合。
7. PZCA-NCs 中生物分子的控制释放：在 pH7.4 条件下，PZCA-NCs 中的姜黄素和印楝素在 72h 内实现了持续、可控的释放，最大累积释放量分别为 64.57ppm（88.2%）和 6.1ppm（88.4%）。零级和 Higuchi 模型更适合描述姜黄素的释放模式，而零级、Higuchi 和 Korsmeyer-Peppas 模型则更适合描述印楝素的释放模式。
8. PZCA-NCs 对黑豆表型的影响：在加速老化条件下，25mL/kg 的 PZCA-NCs 处理的黑豆种子在发芽率（93%）、根长（18.1cm）、苗长（20cm）、干物质产量（0.328g/10 株幼苗）、活力指数 - I（3328）和活力指数 - II（29）等指标上表现最佳。随着老化时间的延长，这些指标虽有所下降，但仍优于对照组。
9. PZCA-NCs 对黑豆生化指标的影响：25mL/kg 的 PZCA-NCs 处理的黑豆种子在加速老化过程中，电导率（）和脂质过氧化（0.097 OD 值）较低，而 α - 淀粉酶活性（）、脱氢酶活性（2.273 OD 值）、过氧化氢酶活性（3.838 μmol 减少 蛋白质）和过氧化物酶活性（ 蛋白质 ）较高。这表明 PZCA-NCs 能够保护种子的细胞膜完整性，维持较高的酶活性，从而延长种子的储存期。
10. PZCA-NCs 对储存病原体感染的影响：PZCA-NCs 处理的黑豆种子在加速老化过程中，受到储存病原体（如黄曲霉、黑曲霉、根霉和镰刀菌）感染的程度明显低于对照组。40mL/kg 的 PZCA-NCs 处理的种子感染率最低，仅为 3%，而对照组高达 24%。随着 PZCA-NCs 浓度的增加，感染率显著降低，这得益于姜黄素和印楝素的抗菌活性。
11. PZCA-NCs 对绿豆象和菜豆壳球孢的生物功效评估：对绿豆象的毒性研究表明，PZCA-NCs 的为 15.76mL/kg，为 149.10mL/kg，40mL/kg 的 PZCA-NCs 可导致 100% 的昆虫死亡率，而对照组仅为 13.33%。对菜豆壳球孢的抑制实验显示，35mL 的 PZCA-NCs 可使真菌菌丝生长抑制区达到 91.11%，40mL 时则完全抑制真菌生长。
12. PZCA-NCs 对有益微生物的生物安全性评估：生物安全性测试表明，PZCA-NCs 与巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌和枯草芽孢杆菌具有良好的兼容性。添加不同浓度 PZCA-NCs 的培养基上，细菌菌落数量与对照组无显著差异，说明 PZCA-NCs 不会对有益微生物的生长产生负面影响。

研究结论与讨论

本研究成功合成了由玉米醇溶蛋白包裹姜黄素和印楝素的纳米胶体 PZCA-NCs，并通过实验和计算分析，全面评估了其对黑豆种子活力和储存期的影响。分子对接研究深入揭示了生物分子与蛋白质的结合模式，为理解其作用机制提供了理论依据。实验结果表明，25mL/kg 的 PZCA-NCs 在提高种子生理和生化指标、减少储存病原体感染方面效果显著，同时对害虫和真菌具有良好的防治效果，且对有益微生物安全。

这一研究成果为开发环保型种子处理剂提供了重要参考，有望在农业生产中广泛应用，减少化学农药的使用，降低环境污染，保障农产品质量安全。同时，该研究也为进一步探索纳米技术在种子科学领域的应用奠定了基础，未来可开展更多关于 PZCA-NCs 在不同作物种子上的应用研究，以及优化其制备工艺和配方，以提高其性能和效果。此外，大规模田间试验也是验证其实际应用价值的关键步骤，有助于推动绿色农业的可持续发展。