解析转录凝聚体动态特性对 CRISPRa 介导基因激活的精准调控机制

为解决 CRISPRa 最佳转录激活机制不明的问题，浙江大学医学院附属第一医院等单位的研究人员开展转录凝聚体动态特性对 CRISPRa 介导基因激活影响的研究。发现其可调节转录爆发，明确凝聚体特性与激活关系。对优化 CRISPRa 技术意义重大，推荐阅读！

　　

转录凝聚体的动态特性调控 CRISPRa 介导的基因激活

论文发表于Nature Communications，论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-56735-8

研究由浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心暨浙江大学医学院细胞生物学系的研究人员开展，于 2024 年 4 月 23 日收到投稿，2025 年 1 月 28 日被接收，并于 2025 年 2 月 14 日在线发表。研究对不同相分离的 CRISPRa 系统进行了表征，强调了设计具有适当特性的基于 CRISPR 的可编程合成凝聚体以有效调节基因表达的基本原理。

研究背景

转录因子（TFs）在真核基因调控中起着核心作用，它们由用于序列识别的 DNA 结合结构域（DBD）和与其他转录调节因子相互作用以促进转录的激活结构域（AD）组成。为了激活基因表达，核酸酶失活的 Cas9（dCas9）变体已与 AD 融合，创建了 CRISPR 激活（CRISPRa）系统。最初开发的 dCas9-VP64 作为第一代激活剂，效率有限。为了改进 CRISPRa 技术，第二代激活剂相继问世，包括 VPR（dCas9-VP64-p65-Rta）、SAM（dCas9-VP64/sgRNA-p65-HSF1）、SunTag10xVP64（或 SunTag24xVP64）、SunTag10x (p65-HSF1)（也称为 SPH）。CRISPR-SunTag 激活剂利用与串联排列的 GCN4 肽融合的 dCas9 或 RNA 噬菌体外壳蛋白（MCP 或 PCP），通过将它们与针对 GCN4 的单链抗体片段（scFV）融合来招募多个 AD，从而使 AD 能够通过 dCas9 或携带 MS2 或 PP7 发夹结构的单向导 RNA（sgRNA）支架被引导到特定的靶位点，增加靶基因转录起始位点（TTS）附近的 TF 浓度，增强转录。

TF 形成凝聚体（TF 凝聚体）的能力备受关注，CRISPRa 技术的最新发展基于液 - 液相分离（LLPS）形成凝聚体的原理，理论上可浓缩 TF 以增强基因激活。然而，转录凝聚体在基因调控中的作用仍存在争议，目前需要不断开发方法和技术来评估相分离在转录调控中的意义。同时，现有的 CRISPRa 系统基因激活评估方法无法准确捕捉动态转录变化，需要新的方法来更精确地评估和优化 CRISPRa 工具。

研究方法

1. 细胞培养：培养了多种细胞系，包括 HeLa 细胞、HEK 293T 细胞、HCT116 细胞、人胚胎干细胞系 H1、小鼠胚胎干细胞（mESCs）等，并维持在相应的培养条件下，定期检测支原体污染。

2. 质粒构建：采用 Gibson Assembly 方法或限制性克隆，经 T4 DNA 连接酶连接构建质粒，通过 Sanger 测序进行验证，所用 sgRNAs 和质粒分别列于补充表 2 和补充数据 1。

3. 报告细胞系构建：建立了一系列用于分析 CRISPRa 效率的报告细胞系，包括外源性报告细胞系（如 miniCMV-TriTagmTagBFP）和内源性报告细胞系（如 HSPB1-BFP、HSPB8-BFP 等），分别通过慢病毒感染和 Cas9 介导的敲入技术构建。

4. 转染：根据不同实验目的，采用 FuGENE 转染试剂或 PEI 进行细胞转染，部分实验通过添加多聚凝胺、明胶等提高转染效率或细胞黏附性，在特定时间点进行成像分析、蛋白表达和 mRNA 丰度检测。

5. 实验检测技术：运用流式细胞术评估 CRISPRa 的激活比率；提取 RNA 进行逆转录和 qPCR 分析，检测基因表达水平；利用 CRISPR-dCas9 介导的 DNA 标记技术标记基因组位点；通过免疫染色检测内源性蛋白；使用 1,6 - 己二醇处理研究凝聚体特性；进行蛋白质免疫印迹分析蛋白表达；开展 RNA 测序评估 CRISPRa 系统特异性；通过荧光漂白恢复（FRAP）实验评估荧光标记蛋白的流动性；运用多种显微镜技术进行荧光成像，获取不同条件下的细胞图像。

研究结果

CRISPRa 工具调节转录爆发动力学

研究人员利用 SunTag 系统构建了多种 CRISPRa 系统，通过追踪 miniCMV-TriTagmTagBFP 位点产生的新生转录本，观察到 CRISPR 激活后的转录爆发现象。分析发现不同 CRISPRa 系统的爆发持续时间存在显著差异，而转录沉默持续时间相对一致。3xVPR 系统的平均爆发持续时间约为 95 分钟，且爆发幅度较高，在 RNA 产生方面表现出色，优于 10xPH 系统。这些结果表明 CRISPRa 工具可通过延长爆发持续时间和增加爆发幅度来增强转录激活，但随着 SunTag-AD 阵列数量的增加，CRISPR-SunTag 激活剂的效率可能会下降。

3xVPR 在基因激活方面优于 10xVPR

在单细胞水平评估 miniCMV 驱动的 BFP 表达水平时，3xVPR 系统在转染 48 小时后，激活率显著高于 VP64、5xVPR、10xVPR 和 10xPH 系统。在不同细胞类型中对多个内源性基因的研究也证实，3xVPR 系统在激活基因方面表现更强，激活率更高。qPCR 分析进一步表明，3xVPR 对多种蛋白编码基因和非编码 RNA 的激活效果优于 VPR、5xVPR 和 10xVPR。这些结果进一步验证了在 CRISPR-SunTag 系统中，增加 AD 数量并不一定能带来更好的激活效果。

CRISPR-SunTag 激活剂的激活特征

构建不同的 CRISPRa-SunTag 系统，研究激活结构域的最佳组装方式。结果显示，当 scFv 与单个 AD 融合时，3xVP64 和 10xp65 的激活效率最高；增加 AD 拷贝数至 24 会显著降低激活强度。当 scFv 与两个或三个 AD 融合时，含有三个 GCN4 重复序列的 SunTag 激活剂比含有十个重复序列的激活效率高得多。这表明在 SunTag 系统中，确定最佳的 AD 拷贝数对实现最高激活率和最大激活水平至关重要。

CRISPR-SunTag 激活剂形成具有不同特性的相分离凝聚体

通过建立 GFP 荧光报告系统，研究人员观察到不同 CRISPRa 系统中 dCas9-GFP-ADs 的亚细胞定位差异。VPR 和 VPRF 系统中 dCas9-GFP-ADs 簇有限且不规则，而其他系统显示出更明亮、圆形的凝聚体，表明 dCas9 聚类程度更高。10xVPR 系统比 3xVPR 系统形成的明亮凝聚体数量更多，FUSn 的加入进一步增强了 3xVPR 和 10xVPR 系统中的凝聚体形成。

对凝聚体进行短期和长期实时成像，发现 VPR 和 VPRF 系统中亮点无融合动态，而 CRISPR-SunTag 系统中的凝聚体呈现液滴样行为和融合现象。1,6 - 己二醇处理实验表明，3xVPR 和 3xVPRF 系统的 GFP 斑点数量和荧光强度显著降低，表明其凝聚体具有液体样特性；而 10xVPR、10xVPRF、PCP-12xVPRF 和 PCP-40xVPRF 系统的凝聚体受影响较小，显示出更强的分子间相互作用。FRAP 实验结果也证实，3xVPR 和 3xVPRF 的凝聚体具有高流动性，而 10xVPR、10xVPRF、PCP-12xVPRF 和 PCP-40xVPRF 的凝聚体流动性受损。综合判断，3xVPR 和 3xVPRF 形成液体样转录凝聚体，而 10xVPR、10xVPRF、PCP-12xVPRF 和 PCP-40xVPRF 形成固体样转录凝聚体。此外，研究还验证了 CRISPR-SunTag 激活剂在 HCT116 细胞中的定位和激活能力，以及其形成 TF 凝聚体的特异性。

可见的 CRISPRa 凝聚体总体水平与基因激活能力无关

量化细胞内所有 dCas9-GFP-ADs 凝聚体的累积信号，并与同一细胞中靶基因的蛋白质表达水平进行相关性分析，发现所有单个 CRISPRa 系统的相关系数均低于 0.1，大多接近 0。这表明高效转录激活并不需要高水平的相分离，合成转录凝聚体的流动性和动态性，而非相分离的总体水平，是促进转录激活的关键因素。

CRISPRa 凝聚体和靶位点转录爆发的动态成像

利用活细胞成像监测 3xVPR 和 3xVPRF 系统中 CRISPRa 凝聚体的形成、定位和动态变化，并同时量化单细胞水平的转录水平。结果显示，随着时间推移，dCas9-GFP-ADs 在细胞核内浓度增加，miniCMV 位点仅在 CRISPR 激活时出现转录爆发。3xVPR 系统最初无可见 GFP 斑点，随后出现；3xVPRF 系统则立即形成许多小凝聚体，最终合并成较大的凝聚体。

研究发现，明亮的凝聚体通常不与新生 RNA 共定位，小凝聚体则靠近或与新生 RNA 共定位。对转录爆发持续时间和幅度的分析表明，在 3xVPR 系统中，两者略有下降；在 3xVPRF 细胞中，转录参数变化不大。在活跃的 miniCMV 转录过程中，有凝聚体存在时的新生 RNA 总量显著高于无凝聚体时。在对内源性 LMNA 位点的研究中也观察到类似现象，即 CRISPRa 凝聚体常富集在转录位点，有凝聚体时新生 RNA 水平显著更高，但凝聚体动态与 RNA 爆发发生之间无显著关系。

CRISPRa 凝聚体的动态特性影响基因激活

构建一系列含有不同 FUSn 拷贝数或其他相分离相关蛋白的 CRISPRa 系统，研究发现增加 FUSn 拷贝数可提高基因激活效率，但用 NUP98n 或 SMN1 替代 FUSn 会显著降低激活效率。标记这些系统的 GFP 显示，与 VPR 融合的 3x 或 10xNUP98n 促进了 dCas9-VPR 凝聚体的形成，且这些凝聚体对 1,6 - 己二醇不敏感，缺乏液体样特性；而 VPR-2x/3xFUSn 形成的可见凝聚体较少，且易被 1,6 - 己二醇破坏；VPR-10xFUSn 形成的凝聚体大小不一，只有较小的凝聚体能被 1,6 - 己二醇有效破坏，且其基因激活能力低于 VPR-2x/3xFUSn。这些结果表明，CRISPRa 凝聚体的流动性影响其基因激活能力。

研究人员进一步研究发现，低流动性的 CRISPRa 凝聚体会捕获共激活因子（如 Mediator 和 p300），导致凝聚体内共激活因子富集，而核质中游离的共激活因子减少，从而降低基因激活能力。1,6 - 己二醇处理和 FRAP 分析表明，p300 的流动性与 CRISPRa 凝聚体的流动性一致，在 3xVPR 和 3xVPRF 中 p300 具有高流动性，而在 10xVPR 和 10xVPRF 中流动性显著降低。

FUSn 辅助的 CRISPRa 系统的设计和比较分析

鉴于 VPRF 和 3xVPRF 是两种高效的 FUSn 辅助 CRISPRa 系统，研究人员尝试开发更有效的系统。通过替换 VPRF 系统中的 VPR 为其他单个或组合的 AD，并构建类似 3xVPRF 的系统进行评估。结果显示，VPRF 在激活外源性和内源性基因方面表现最佳，3xPRF 和 3xVRF 的激活水平与 3xVPRF 相当。增加 CRISPR-SunTag 系统中 AD 和 FUSn 的数量会导致激活效率急剧下降。在干细胞中，3xVPR 在激活特定基因方面表现出色，在诱导神经分化实验中，3xVPR 和 3xVPRF 系统的分化效率显著高于其他系统，尤其在使用单个 sgRNA 时表现更优。

研究讨论

本研究通过在相同细胞环境中定量评估转录动力学，全面比较了不同的 CRISPRa 系统。发现 CRISPR 激活剂中 SunTag-AD 阵列数量在一定范围内增加可增强转录激活能力，但超过一定范围（如十个 VPR 拷贝）会导致激活能力丧失。

将多价分子整合到 CRISPRa 平台可能是增强基因激活的有效策略，但过量的多价相互作用（如过多的 FUSn 拷贝或用 NUP98n、SMN1 替代 FUSn）会导致凝聚体对 1,6 - 己二醇抗性增加，降低基因激活能力。CRISPRa 凝聚体会隔离共激活因子，其流动性和动态性与 CRISPRa 分子相似，这解释了为何过量多价相互作用会降低激活能力。因此，最佳的相分离，即反映 CRISPRa 平台中适当多价相互作用的状态，可在转录起始位点周围创造有利的微环境，促进高效激活。

转录凝聚体在基因激活中的作用存在争议，可能与凝聚体的组成、性质以及细胞类型和基因特异性效应有关。研究发现基因激活强度与凝聚体的动态性和流动性呈正相关，而非凝聚体的总体形成水平。基于此，研究人员提出最佳相分离的 CRISPRa 系统可能产生不可见但能有效浓缩转录因子和共激活因子的转录凝聚体，较大的可检测凝聚体需保持流动性和动态性以促进分子自由扩散。

CRISPRa 为基因激活提供了精确、通用和可扩展的方法，在研究基因功能和调控以及潜在疾病治疗方面具有重要意义。本研究中 3xVPR 和 3xVPRF 相分离凝聚体表现出较高的激活能力，未来研究可基于此选择最佳支架和调节合成转录凝聚体内的多价相互作用，以实现最大程度的基因激活。