重大突破！溶酶体 NKG7—— 调控 CD8+ T 细胞代谢与命运，开启癌症免疫治疗新篇

为解决 CD8+ T 细胞调节 mTORC1 机制不明等问题，梅奥诊所的研究人员开展 NKG7 对 CD8+ T 细胞作用的研究。结果发现 NKG7 可调控 mTORC1，影响细胞耐久性和肿瘤控制。推荐阅读，助您把握免疫学与癌症治疗前沿！

　　

梅奥诊所（Mayo Clinic）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Lysosomal NKG7 restrains mTORC1 activity to promote CD8+ T cell durability and tumor control” 的论文。该研究在免疫学和癌症治疗领域具有重要意义，为深入理解 CD8+ T 细胞（细胞毒性 T 淋巴细胞，在免疫反应中发挥关键作用，能识别并杀伤被病原体感染的细胞或肿瘤细胞 ）的代谢调控机制以及开发更有效的癌症免疫疗法提供了新的思路。

研究背景

在感染和癌症发生过程中，mTORC1（雷帕霉素靶蛋白复合物 1，是细胞代谢的关键调节因子 ）介导的代谢调节对 CD8+ T 细胞的效应扩张和记忆发展影响重大。然而，CD8+ T 细胞如何调节 mTORC1 以满足自身独特的代谢需求，这一机制一直是未解之谜。溶酶体作为细胞内的重要细胞器，处于 CD8+ T 细胞细胞毒性和代谢的关键节点，不仅参与大分子的降解和循环，还对细胞内的多种生理过程如膜修复、细胞运动、黏附、自噬通量和代谢信号传导等有广泛影响，同时也是 CD8+ T 细胞杀伤作用所需的溶细胞分子（穿孔素和颗粒酶）所在的溶酶体颗粒生成的关键场所。但溶酶体在 T 细胞代谢中，对于平衡 T 细胞的细胞毒性潜力和持久性方面的作用尚不明确。

mTORC1 作为真核细胞代谢的主要调节因子，在细胞生长、存活和命运决定中扮演着关键角色，其失调与多种人类疾病相关。尽管细胞内外信号激活 mTORC1 的机制已部分阐明，但这一核心代谢机制如何在特定细胞类型中进行精细调节和优化，尤其是在不断遭遇动态变化微环境（如循环系统与组织 / 肿瘤环境）的 CD8+ T 细胞中，仍有待探索。

细胞毒性 CD8+ T 细胞在清除病毒感染细胞和肿瘤细胞过程中至关重要，大多数癌症免疫疗法的成功都依赖于 CD8+ T 细胞对肿瘤细胞的有效杀伤。CD8+ T 细胞的代谢状态会随着细胞激活、效应功能发挥和记忆生成而动态重编程，不过，CD8+ T 细胞根据自身内在信号或整合外部信号转变为不同代谢模式，以满足代谢需求的细胞内途径尚不清楚。明确这些调节步骤，对于理解 CD8+ T 细胞在营养受限的恶劣微环境（如慢性病毒感染和肿瘤环境）中，如何维持细胞毒性潜力、存活和记忆分化至关重要。

此前研究发现，NKG7（自然杀伤细胞群 7，也称为颗粒膜蛋白 - 17 [GMP - 17]，是一种定位于溶酶体的 4 次跨膜蛋白，主要在细胞毒性免疫细胞如 CD8+ T 细胞和 NK 细胞中表达 ）的表达与癌症患者对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的持久 CD8+ T 细胞反应有关，但其除了调节细胞毒性外是否还有其他功能，尚未可知。

研究方法

1. 细胞实验：使用多种细胞系，包括人外周血单个核细胞（PBMC）来源的 CD8+ T 细胞、NK 细胞，以及 Jurkat CD4+ T 细胞、HEK293T 细胞等。通过基因编辑技术（CRISPR Cas9/RNP 系统）敲除或过表达 NKG7 基因，观察细胞的变化。同时，对细胞进行各种处理，如使用药物（vacuolin - 1、醋酸林格氏液、nocodazole、bafilomycin A1、rapamycin 等）调节细胞内的生理过程，利用 Seahorse 分析检测细胞的代谢指标（如氧消耗率 OCR 和细胞外酸化率 ECAR），通过免疫荧光显微镜观察细胞内蛋白质的分布和细胞器的形态，运用免疫印迹法检测蛋白质的表达和磷酸化水平等。
2. 动物实验：使用多种小鼠品系，包括 C57BL/6、B6.SJL、Nkg7 基因敲除小鼠、LCMV H2 - Db gp33 特异性 TCR 转基因 P14 小鼠以及 CD8+ T 细胞特异性 NKG7 转基因小鼠等。对小鼠进行病毒感染实验（如感染 LCMV Armstrong 或 LCMV - Clone 13 病毒），观察 NKG7 对 CD8+ T 细胞在体内抗病毒免疫反应中的作用；构建肿瘤模型（如皮下注射 MC38 结肠腺癌细胞），研究 NKG7 过表达对 CD8+ T 细胞抗肿瘤免疫的影响。在实验过程中，对小鼠的组织和细胞进行分离、检测，如通过流式细胞术分析细胞表面和细胞内标志物，测定肿瘤大小和病毒滴度等。
3. 蛋白质相互作用研究：运用免疫沉淀（IP）结合质谱分析、TurboID 邻近标记结合质谱分析等技术，鉴定与 NKG7 相互作用的蛋白质。同时，利用公共数据库（如 NKG7 - Y2H 数据库）进行分析，筛选在人 CD8+ T 细胞中表达的相关蛋白质。
4. 临床数据分析：分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库中不同癌症患者的 NKG7 基因表达与总体生存的关系，对 158 例接受根治性膀胱切除术的肌肉浸润性膀胱癌患者的肿瘤浸润 T 细胞进行 NKG7 蛋白表达评分，评估其与患者总体生存的关联。

研究结果

1. NKG7 对溶酶体稳态的调节：研究人员通过敲除或过表达 NKG7，发现 NKG7 敲除会导致人原代 CD8+ T 细胞和 NK 细胞的溶酶体聚集 / 增大且数量减少，而过表达 NKG7 则使 Jurkat CD4+ T 细胞和 HEK293T 细胞的溶酶体变小、数量增多且分布更分散。进一步研究表明，NKG7 可能通过调节溶酶体的融合和 / 或裂变来维持溶酶体稳态。此外，NKG7 敲除会增加晚期内体（LEs）与溶酶体的融合，形成更多含有两者标记的杂交细胞器。
2. NKG7 对 CD8+ T 细胞代谢活动的调节：NKG7 敲除的预激活 CD8+ T 细胞糖酵解和总糖酵解能力增强，而线粒体呼吸未受显著影响。在慢性 T 细胞激活过程中，NKG7 敲除的 CD8+ T 细胞 mTORC1 活性增强，表现为 S6 蛋白（mTORC1 的下游靶蛋白 ）磷酸化水平升高，且细胞对葡萄糖类似物（2 - NBDG）的摄取增加、细胞体积增大。这些结果表明 NKG7 限制了 mTORC1 介导的 CD8+ T 细胞激活和代谢。
3. NKG7 对 mTORC1 向溶酶体转位的抑制作用：在 NKG7 敲除的 CD8+ T 细胞中，mTOR 在溶酶体上的比例增加；而在 Jurkat 细胞中异位表达 NKG7 则减少了溶酶体相关的 mTOR。在氨基酸刺激实验中，表达 YFP - NKG7 的细胞 mTOR 向溶酶体的募集减少，且 mTORC1 激活延迟。这说明 NKG7 负向调节氨基酸介导的 mTOR 向溶酶体的转位及后续激活。
4. NKG7 对 v - ATPase（液泡型 ATP 酶 ）依赖性溶酶体酸度和 mTORC1 调节的影响：通过蛋白质组学分析，研究人员发现 NKG7 与 v - ATPase 的多个组分（如 ATP6V0d1 和 ATP6AP2 ）以及 Ragulator 复合物亚基（如 LAMTOR1 ）存在潜在相互作用。NKG7 敲除会导致人、小鼠 CD8+ T 细胞和人 NK 细胞系 YTS 的溶酶体酸度增加，而过表达 NKG7 则使 Jurkat 和 293T 细胞的溶酶体更偏碱性。此外，抑制 v - ATPase 活性或敲除 ATP6AP2 可逆转 NKG7 敲除导致的 mTORC1 激活增强和 mTOR 在溶酶体上的异常定位。这表明 NKG7 抑制 v - ATPase 依赖性溶酶体活性和 mTORC1 向溶酶体的募集。
5. NKG7 对 v - ATPase 活性的调节机制：NKG7 通过抑制 v - ATPase V0 - V1 结构域的结合来降低其活性。在表达 NKG7 的 293T 细胞中，溶酶体上 v - ATPase V1 结构域亚基（如 ATP6V1A1 和 ATP6V1E1 ）水平降低，而 V0 亚基（如 ATP6V0a1 和 ATP6V0d1 ）和辅助亚基（ATP6AP2 ）水平增加。通过邻近连接分析（PLA）发现，NKG7 过表达减少了细胞内 V0 - V1 结构域组装的 PLA 斑点数量，而 NKG7 敲除则增加了 YTS NK 细胞中的 PLA 斑点数量。这表明 NKG7 干扰 V0 - V1 结合，影响 v - ATPase 的功能。
6. NKG7 对 Ragulator 复合物定位和相互作用的影响：NKG7 影响 Ragulator 复合物向 v - ATPase 所在的溶酶体区室的募集及后续 mTORC1 的激活。在正常 CD8+ T 细胞中，LAMTOR1 与 LAMP1 的分布存在特定模式，但 NKG7 敲除后这种模式消失，LAMTOR1 与 LAMP1 分布重叠增加。在不表达内源性 NKG7 的 Jurkat 和 293T 细胞中，LAMTOR1 与 LAMP1 分布重叠，而异位表达 NKG7 可使其呈现类似正常 CD8+ T 细胞的分布。此外，NKG7 表达降低了与 LAMTOR1 结合的 v - ATPase 亚基水平，表明 NKG7 破坏了 v - ATPase 与 Ragulator 复合物的相互作用。
7. Nkg7 对病毒感染中 CD8+ T 细胞反应的影响：在 LCMV 感染实验中，敲除 Nkg7 的 P14 CD8+ T 细胞在感染初期正常扩增，但随后数量急剧下降。感染 LCMV - Arm 后，Nkg7 敲除的 P14 细胞中 CD62L + 中央记忆子集比例降低，记忆前体细胞百分比减少，而 KLRG1 + 终末效应 CD8+ T 细胞增多；感染 LCMV - Cl13 后，Nkg7 敲除的 P14 细胞 KLRG1 表达异常升高，且在感染 30 天后，其总数和干细胞样 Ly108+ P14 细胞的积累显著减少。同时，感染 LCMV - Cl13 的 CD8 特异性 Nkg7 敲除小鼠肾脏病毒滴度增加。给予 v - ATPase 抑制剂 BafA1 或低剂量雷帕霉素抑制 mTORC1，可部分挽救 Nkg7 敲除 P14 细胞的命运。此外，敲除 Atp6v0d1 也能显著挽救 Nkg7 敲除 P14 细胞的记忆积累。这表明 Nkg7 通过负向调节 mTORC1，对 CD8+ T 细胞在病毒感染中的长期反应至关重要。
8. CD8+ T 细胞特异性 NKG7 过表达对肿瘤免疫的影响：构建 CD8+ T 细胞特异性 NKG7 转基因小鼠模型，发现该模型小鼠在接种 MC38 结肠腺癌细胞后，肿瘤生长明显延迟。在肿瘤组织中，NKG7 转基因小鼠的 CD8+ T 细胞浸润增加，且功能性（IFN - γ+ 和 CD107a+ ）CD8+ T 细胞比例更高，但溶细胞颗粒内容物（穿孔素和颗粒酶 B ）的表达在转基因小鼠和对照小鼠中无显著差异。这表明 CD8+ T 细胞特异性过表达 NKG7 可增强体内抗肿瘤免疫。
9. NKG7 表达与膀胱癌患者生存的关系：分析 TCGA 数据库发现，在多种癌症中，NKG7 基因表达与患者总体生存相关。在膀胱癌患者中，高 NKG7 表达与较长的总体生存时间相关。对 158 例膀胱癌患者的肿瘤浸润 T 细胞进行 NKG7 蛋白表达评分，进一步证实高 NKG7 表达与更好的预后相关，且 NKG7 是膀胱癌患者总体生存的独立预测因子。

研究结论与讨论

该研究表明，NKG7 不仅是细胞毒性的调节因子，更是 CD8+ T 细胞中 mTORC1 活性的关键调控者。NKG7 通过干扰 v - ATPase 在溶酶体的组装，负向调节 mTORC1 活性，这一过程影响了 CD8+ T 细胞的持久性和记忆生成，在感染和肿瘤免疫中发挥着重要作用。

此前研究已知 NKG7 缺失会导致 CD8+ T 细胞和 NK 细胞的溶酶体颗粒释放缺陷，本研究进一步发现 NKG7 缺失会导致溶酶体异常融合，形成更多 LE / 溶酶体杂交细胞器，而过表达 NKG7 则使溶酶体变小、数量增多。虽然 NKG7 调节这些过程的具体机制尚待明确，但这些杂交细胞器可能影响溶酶体颗粒的正常成熟和与质膜的融合，类似 Chediak - Higashi 综合征患者的情况。此外，NKG7 与 v - ATPase 的相互作用以及对其活性的抑制，为理解 mTORC1 在 CD8+ T 细胞中的调节提供了新的视角。

在病毒感染过程中，Nkg7 对维持 LCMV 特异性 CD8+ T 细胞的长期反应至关重要，其缺失会优先影响具有长期存活特性的 CD8+ T 细胞亚群，如 CD62L + 中央记忆细胞和干细胞样耗尽的 Ly108 + 细胞。目前尚不清楚这是 Nkg7 对已形成的记忆样前体细胞的特异性作用，还是在效应阶段促进细胞存活的结果。未来通过单细胞水平追踪 Nkg7+ CD8+ T 细胞的命运，将有助于明确 Nkg7 在不同记忆 CD8+ T 细胞亚群中促进存活的具体机制。

在癌症免疫治疗方面，本研究结果表明，肿瘤浸润 T 细胞表达 NKG7 对于优化其在肿瘤微环境中的抗肿瘤活性至关重要。CD8+ T 细胞特异性过表达 NKG7 可增强体内抗肿瘤免疫，且 NKG7 表达与膀胱癌患者的长期生存相关，有望成为预测癌症患者免疫治疗反应和预后的可靠生物标志物。未来研究可进一步评估 NKG7 在不同免疫细胞亚群中的作用，以及利用人源化小鼠模型深入探究 Nkg7 对人 CD8+ T 细胞抗癌反应的影响，为开发更有效的癌症免疫疗法提供理论依据和潜在靶点。